Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 68
Текст из файла (страница 68)
Эти процедуры аналогичны тем, которые используются для отбора определенных классов рекомбинантов, образующихся при скрещиваниях бактерий или дрожжей. Отсутствие у родительской линии мышиных клеток какой-либо существенной функции, например способности синтезировать необходимый метаболит, может быть супрессировано при внесении элементов генома человека. Из такой гибридной линии могут постепенно утратиться все человеческие хромосомы, кроме той, которая содержит ген, отвечающий за незаменимую функцию.
Таким образом, можно отобрать гибридные клоны, содержащие конкретные человеческие хромосомы. Такой предварительный отбор облегчает картирование генов, расположенных в этой хромосоме. Один очень широко используемый метод отбора гибридных клеток называется НАТ-селекцией. Это название — аббревиатура английских на- Клетк лефек ( туре, лит тарын Потеря неловенеской хромосомы 17 сокр снне «роносоны 1т / о Несносабнасть к росту о Стабильные клоны Рнс. 18.6. Отбор стабильных гибридных клеточных клонов по методу НАТ. В том случае, если родительская линия клеток мыши лишена тимидинкинаэной активности, иа селективной среде НАТ будут образовывать колонии только гибридные клетки, содержащие хромосому человека 17.
В этой хромосоме расположен теи ТК человека. Экспрессия генетического материала 18. Генетика соматических клеток: картирование генома званий веществ: гипоксантина, аминоптерина и тимидина, присутствующих в селективной среде. Аминоптерии блокирует синтез пурииов и пиримидинов. Для того чтобы синтезировать ДНК, клетки должны реутилизировать пурины и пиримидины, образующиеся при деградации полинуклеотидов.
В обмене нуклеотидов принимае~ участие большое количество ферментов. Один из этих ферментов-тимидинкиназа (ТК), осуществляющая превращение тимидина в тимидинмонофосфат. Если в используемой мутантной линии клеток мыши отсутствует этот фермент, то иа селективной среде НАТ, в которой отсутствует тимидинмонофосфат, могут расти клетки, получившие хотя бы одну из гомологичных хромосом человека, содержащих ген ТК.
Цитологические исследования показали, что все отбираемые клеточные линии содержат хромосому человека 17 (рис. 18.6). С помощью таких клеточных линий могут быть картированы и другие гены человека (помимо гена ТК), локализованные на семнадцатой хромосоме. Задача сводится к идентификации продуктов генов человека, которые нарабатываются в отобранных гибридных линиях. Селективная среда НАТ может быть использована для отбора клонов, содержащих и другие хромосомы. Например, фермент фосфорибозил-гипоксантин — трансфераза (НРКТ) участвует в синтезе пуринов. Если линия клеток мыши утрачивает способность синтезировать НРВТ, то этот дефект может быть возмещен присутствием соответствующего гена человека.
Показано, что все гибридные клоны, отобранные по этому признаку, содержат человеческую Х-хромосому, в составе которой находится геи НРЯТ. Разработаны другие селективные схемы, позволяющие проводить картирование генов, локализованных и на других хромосомах, кроме Х и !7. Поздние профазные и метафазные хромосомы человека после инкубирования в лимонной кислоте и окрашивания красителем Гимза покрываются темными и светлыми поперечными полосами разной ширины (О-полосы).
Характер распределения этих полос различен для большинства хромосом и является строго воспроизводимым. После инкубации с акрихинипритом при освещении ультрафиолетом выявляются флуоресцируюшие О-полосы. Распределение выявляемых полос при обоих типах окраски совпадает. Это свидетельствует о том, что такое окрашиваиие визуализирует какие-то реально существующие структуры хромосом. На парижской конференции 197! г. была разработана номенклатура для обозначения О-полос. Для обозначения короткого и длинного плеч хромосомы используют буквы р и ц. Каждое хромосомное плечо разделяется иа районы, нумеруемые по порядку от центромеры к теломерной области. В некоторых плечах выделяют один такой район, тогда как в других — 2 — 4 района.
Полосы внутри районов также нумеруются по порядку от центромеры. Запись 1р36 означает, что рассматривается шестая полоса района 3 короткого плеча первой хромосомы, наиболее заметная полоса в этой хромосоме. На рисунке 18.20 изображены полосы на хромосомах человека и соответствующая нумерация. Полосы могут иногда быть разделенными на суб-полосы, видимые в поздней профазе. Эти ЗОО Слева направо, дифференциальная сегментация С-типа пары хромосом 1 на стадиях 400, 550, 850, 1000 и 1200 полос. (Соиггезу уогве 1.
г'оипй о( Мшпезога.) Схема хромосомы !4 иа стадиях 400 (слева), 550 (е центре] и 850 (справа) полос, иллюстрирующая использование парижской номенклатуры для обозначения плеч хромосом, районов, полос и суб-полос. (По Уили 1.Е, 1981. СЬгоюозоюез апг) сапсег: иеи поюелс1аюге аог( бниге о(гесгюпв, Ншв. Рапз. 12, 494 — 503.) суб-полосы сливаются в единые полосы на метафазных хромосомах. Для обозначения этих суб-полос в номенклатурный индекс вводится точка. Нумерация суб-полос также идет от центромеры к теломере, например 1р36А и 1.36.2. В том случае, если локализация гена внутри хромосомы известна, для ее обозначения используют индекс полосы. Например, локализация гена Е5)у, кодирую- щего эстеразу 13, обозначается ! Зр!4-четвертая полоса первого района короткого плеча тринадцатой хромосомы.
Локали- Экспрессия генетического материала зация генов не всегда известна с точностью до полосы. Так, «адрес» гена ЕЫ (ретинобластома-1) — 130, что означает расположение в длинном плече тринадцатой хромосомы. Стрелка, объединяющая два участка хромосомы, используется в тех случаях, когда ген нельзя локализовать более точно. Так, расположение гена МАХА, кодирующего а-маннозидазу-А, обозначается ! 5г)11 — цгег. Это означает, что ген находится в длинном плече пятнадцатой хромосомы между полосой 11 и терминальным районом. 18. Геиелшка соматических клеток: картироеание генома Внутрихромосомное картирование генов с помощью хромосомных перестроек Идентификация индивидуальной хромосомы, в которой находится исследуемый ген,— зто только первый этап картирования. Основной задачей являются установление порядка генов и их точная локализация. В некоторых случаях метод анализа родословных позволяет расположить на генетической карте хромосомы трн и более маркеров.
Использование более эффективных методов генетики соматических клеток может дать более точную информацию. Существенную помощь в таких исследованиях оказывают хромосомные перестройки (см. гл. 21). Далее мы рассмотрим примеры использования делеций, транслокаций илн дупликацнй для картирования генов. Ген, кодирующий кислую фосфатазу 1 (АСР1) эритроцитов, расположен на второй хромосоме. При цитологическом изучении кариотипов двух детей (из двух разных семей), которые обладали множественными врожденными аномалиями, удалось показать наличие делеции терминальной области короткого плеча второй хромосомы. У одного из детей делецня хромосомы начиналась с терминального района полосы 2р23 (рис.
18.7). Культура клеток, полученных от этого ребенка, обладала АСР!-активностью. Этн клетки несли аллель А в одной из гомологичных хромосом и аллель В в другой. У второго ребенка делеция захватывала н проксимальный район полосы 2р33. Клетки, содержащие такую хромосому, были лишены активности это~о фермента. Таким образом, можно заключить, что ген АСР! локализован в полосе 2р23 (рис. 18.8). У культивируемых клеток часто обнаруживаются хромосомные перестройки, отсутствующие у индивидуумов, которые служили донорамн исходных клетох.
В других случаях перестройки, например трансло- Ряс. 18.7. Вторая хромосома ребенка, несущая делецию терминального фрагмента короткого плеча. Сплошная стрелка указывает положение цеитромеры. Пунктирная стрелка — место разрыва в полосе 2р23. В эрнтроцнтах этого ребенка присутствует фосфатаза 1 (По Еттаиие! 8.5. ег а!., 1979. Аш. 8 Мед. Оеце1., 4, 1б7 — 172.) 302 лсщ 4 Е хр м,х кации, уже присутствуют в мутантных организмах. На рис. 18.9 изображена транслокация, произошедшая между хромосомой 14 и Х-хромосомой.
Эта транслокация была исследована цитологическими методами. В гибридной линии клеток произошла утрата всех человеческих хромосом. Сохранилась только хромосома 14, несущая транслоцированное длинное плечо Х-хромосомы. У этих клеток обнаруживается экспрессия трех генов, локализованных в Х-хромосоме. Это НРКТ, кодирующий фосфорибозил-гипоксантин — трансферазу, РБК, кодирующий фосфоглицераткиназу, и БбР1), кодирующий глюкоза-6-фосфат — дегидрогеназу. Таким образом, если транслоцированный сегмент хромосомы начинается с полосы Хг)12, то можно считать, что все три гена располагаются между этой полосой и терминальной областью.
В этой же клеточной линии показана экспрессия аутосомного гена, кодирующего нуклеозидфосфотрансферазу 174Р) и локализованного, таким образом, в составе четырнадцатой хромосомы. Обнаружение двух дополнительных транслокаций, в которые были вовлечены более короткие фрагменты Х-хромосомы, позволило определить порядок изучаемых генов. Этот порядок-НРКТ вЂ” РБК вЂ” БбРТ7 — в направлении к терминальной области Хг), Изменение уровня накопления фермента может помочь картировать соответствующий дуплицированный ген. Ген БОТ1, кодирующий растворимую глутамат-оксалацетат — трансаминазу, расположен в хромосоме 10.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
