Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 70
Текст из файла (страница 70)
Глобииовые кДНК-зонды использовали для тестирования в растворе препаратов ДНК, выделенных из различных гибридных клонов. Образование стабильного дуплекса между кДНК- зондом и ДНК исследуемого препарата свидетельствовало о присутствии человеческих глобиновых генов в геноме соответствующей гибридной линии. Кариологический анализ выявленных таким образом гибридных клонов позволил заключить, что гены 8-глобинового семейства расположены в хромосоме 11, а и-глобнновые гены — в хромосоме 16. Для проведения гибридизационного анализа в растворе требуется большое количество ДНК.
Дополнительные затруднения связаны также с возможностью перекрестной гибридизации между гомологичными генами человека и мыши. Многие из этих трудностей могут быть преодолены с помощью блот-гибридизации по Саузерну. На первом этапе соответствующий ДНК-зонд метят радиоактивными изотопами (такими, как ~~Р или Н) с помощью ник-трансляции. Затем из гибридных линий клеток, несущих определенные хромосомы человека, выделяют препараты тотальной ДНК.
Как показано на рис. 18.17, эти препараты ДНК 18. Генетика соматических клеток: картирование генома 309 Таблица 18.2. Ферментные маркеры, используемые для определения групп сцепления генов человека при работах с культурами клеток Хромосома Плечо Фермент (енмпоп гена) 10 11 12 13 14 !5 1б !7 18 19 20 21 22 Х По засох ТВ. (!982). Адк Ноюпп Оепеясе, 12, 341-452. обрабатывают рестрицирующими эндонуклеаэами, а полученные фрагменты ДНК разделяют гель-электрофорсзом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные мембранные фильтры. На фильтрах осуществляется гибридизация с тем или иным меченым ДНК-зондом.
Для большей эффективности можно разделять амплифицированные фрагменты хромосомной ДНК. Для этого используют их предварительное клонирование на фаговых векторах. После гибридизации фильтры накладывают на рентгеновскую пленку, на которой после проявления обнаруживаются полосы, соответ- Р Р Ч Ч Р Ч Р ? р? Ч Р Ч Ч Ч Р Р Ч Ч Р Р Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч Ч ? з Енолаза 1(ЕНО!) Фосфоглюкомутаза — 1 (РОМ!) Пептидаза-С (РЕРС) Фумаратгидратаза (РН) Малатдегидрогеназа-1 (МОН1) Изоцнтратдегндрогеназа-! (!РН1) Амнноацнлаза-! (АСИ) Пептидаза [РЕРЯ) Фосфогнюкомугаза-2 (РОМ!) [)-гексозаминцдаза-В (НЕХВ) Глиоксалаза 1 (6ЕО) Супероксилдисмутаза-2 (8002) Малатдегидрогеназа-1 (МЕ1) [)-глюкуронцназа (6(78В) Глугатнонредуктаза (658) Аконитаза-1 (АС01) Аденилаткиназа-! [АК1) Глутамат-оксалоацетат — трансами паза-! (60 Т1) Лактатдегидрогеназа-А (ЕОНА) Триозофосфатизомераза-1 (ТЯН) Пептидаза-В (РЕРВ) Эстераза-)Э (ЕЕВ) Нуклеотидфосфорилаза (НР) Маннозофосфатизомераза (МР1) Пируваткиназа-М2 (РКМ2) Аденозинфосфорибозилтрансфераза [АРЯ Т) Галактокнназа (ОАПЕК) Пелтидаза-А (РЕРА) Глюкозофосфат-изомераза (6Р1) Пептндаза (РЕРВ) Аденозицдезаминаза (АОА) Суперокснддисмутаза (500!) Аконитаза-2 (А С02) Глюкоза-фосфатдегидрогеназа (66РН) Фосфоглицерокиназа [РОК) 310 Клоп гибридных клеток человек — мышь Клетки для кериотнпировзния ЛНК Гсыогеиат Расщепление рестрнктазами Электрофорез в крахмальном геле для онреаеления ферментных маркеров Х ромосомный набор гибридных клеюк Разделение фрагментов злектрсфорезом в агерозном геле фрагментов на целлюлоэный филмр, валия с зондом, енным'т Р Релиоавтографня филыра, проявление пленки для выявления гнбриднзующихся э он Рис.
18.17. Картирова- ние клонированных ге- нов человека при ис- пользовании гибридов соматических клеток мыши и человека с по- мощью блат-гибриди- зации по Саузерну. Присутствие хромосом человека определяется при цитологическом изучении гибридных клеток. Ферменты, слу- жащие маркерами данных хромосом, вы- являются с помощью гель-электрофореза.
Ре- стрикционные фраг- менты ДНК, выделен- ной из гибридной ли- нии, разделяют злек- трофорезом в агароз- ном геле и переносят иа нитроцеллюлозный фильтр. На этом фильтре проводят их гибридизацию с зон- дом, меченным ра- диоактивными изотопа- ми. (По бйожз Т,В. ег а!., 1982. Аач. Ншп, Пепе!., 12, 341 — 452,) Корреляция между присутствием ферментного маркера, определенной хромосомы 4 и определенной полосы при гибридизапии позволяет соотнести исследуемый ген с той или иной хромосомой человека Экспрессия генетического материала 311 18.
Генетика соматических клеток: картирование генома Рнс. 18.18. Анализ гибридных клеток по методу Саузерна ДНК гн- брялных клеток мышь-человек обра- батывали рестриктаэой НтдП1 н ги- бридизовалн с зондом протяжен- ностью 900 п.н., содержащим ви- русный онкоген тус. На первой до- рожке электрофореграммы глбриди- зуется полоса, соответствующая по- энпни фрагмента ДНК человека, на второй — фрагмента ДНК мыши. На порожках 3-13 фракпионированм фрагменты ДНК из гибридных линий. Последовательности человека, гомологнчныс тус, присутствуют в клонах 3, 5, б, 9, 1! н 12. (По звхаднсрл А. У.
е! а1. 1983, 8стабс Се!1 Оеае6сн 9, 391 — 405.) ствующие рестрикционным фрагментам, содержащим последовательности ДНК, гомологичные данному зонду (рис. 18.18). Гены соотносят с определенными хромосомами человека на основании корреляции между присутствием данной хромосомы в гибридной клеточной динии и наличием гибрндизующегося фрагмента человеческой ДНК на радиоавтограмме. Данный метод более чуствнтелен, чем гибридизация ДНК в растворе н, главное, более специфичен. Результаты эксперимента по картированию гена химотрипснногена В (СТКВ) приведены в таблице 18.3, «Плюсы» и «минусы» во втором столбце таблицы отражают результаты гибридизации по Саузерну.
Следующие столбцы таблицы указывают на присутствие тех нли иных хромосом человека в гибридных линиях. Единственная хромосома, которая имеется во всех гибридных клеточных линиях, дающих положительный ответ в блат-гибридизации, н отсутствует в линиях, дающих отрицательный ответ,-это хромосома 1б. Метод гибридизации по Саузерну, соединенный с подходами, разработанными для генетического анализа соматических клеток, с успехом применялся не только для картирования определенных генов (табл, !8.4), но и для локализации последовательностей ДНК с неизвестными функциями, найденными в библиотеках генов человека.
Таблица 18.3. Локализация гена химотрипсииогеиа в хромосоме 16 Хромосомы, присутствуилцие в клеточиой линии Лилия клеток Экспрессия химотрипси- иагела В + + + 4 + + + 4 4 + 1. ТЯ:2 2. 1СЧ.-15 3. ХЕК-11 4. ХЕК-7 5. ЕХК-3 б. ХЕК-9 7. ЕХК-9 5. МАК-2 9. 1711А-5 ВВАЕА 10.
ХТК-22 1!. КЕХ-12 12. АЕК-1ВВН6 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Ю 21 22 Х + + + + + + — 4 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 4 + + + + Е + 1кЗ и 3 о Ы И о 4 Е 18. Генетика соматических клеток: картироеанне генома Таблвпа 18.4. Человеческие гены и их семейства, картированные с помощью рестрнкционного анализа (некоторые нз этих последовательностей ДИК поли- морфны) Тнпв Хромосомная воквднзванв Повныорфнзы ДНК Гены С С 17921 — Чгег 20 229!! — Чгег 6,9,Х, х'вв 22 в* вв * 8-Однокоонйные гены, С-коыовктно рвсподоженные семействе генов.
О-днсоергнроввнные семействе генов *в Семейства генов, нредстввнтелн которых расположены дополнительно нв какнхлибо еше хромосомах помимо ндентнфаннроввнных. (составлено по еивгееьы Р. О„ Квай!е Р.Н. (!983) 84!еоее, 239, 9!9 — 924) Гибридизация 1п я1ы( Вышеописанная процедура определения хромосомной локализации генов включает в себя два основных этапа. Первый этап заключается в цитогенетической идентификации хромосом или фрагментов хромосом, присутствующих в гибридной линии клеток. На втором этапе с помощью гибридизации ДНК, в растворе или по методу Саузерна устанавливают наличие искомых последовательностей.
Более прямой Гомолог С-)оз (СРОК) Легкая цепь !дя(76К) Проовиокортин (РОС) Гомолог С-туЬ (СМУВ) Пролактин (РЯ1~ Коллаген, тип 1, а2 (СОПА2) Гомолог С-тов(СМОо! Гомолог С-тус(СМ УС) а-ннтерферон ()Р!.) 8-интерферон (1РР) Гомолог С-аЫ(САВЕ) Гомолог С-гавН(СВАЕ) Инсулин ())зо! 8-слабин (НВВ) Гомолог С-газв(СКАВК) Тяжелая цепь Уд(ТОН) Гомолог СГех(СРЕ5) а-глобин (НВА) Химотрипснноген В (СТИВ) Гормон роста (6Н) Хорионнческий соматотропин (СЯН) и плацентарный лактоген (РВ) Колдаген типа 1, а!(СОМА!) Гомолог С-хгс(СЕВС) Гомолог С-з!х(СЯС) Аргнниносукцннатсинтетаза (АЯз! Легкая цепь 4 нммуноглобулина (!Ое) ()-тубулин 2 2 2р 6 6 7 8 8 9рсег — ! 2 9р сег — 12 9 Пррб ! 1р)5.5 — р!3 1!р1208 — р1205 12 14932З !5 ! брсег — р11 !6 17921 — Ч Сег 314 'ФВ 9йзязя ~ и 6 йети 6 7 Ьй р ф й, й ° фф е!в )ж! ° Уи, 1вт ювв 5вввз 9 1О В-.з 11 !2 13 14 15 й к двг И $$! 4 вшя в ~ 19 20 ы 16 21 22 у способ картирования генов заключается в непосредственной гибридизации между радиоактивными зондами н метафазнымн хромосомами.
Этот метод гибридизации 1и ящ был разработан для дрозофилы, большие политенные хромосомы которой, несущие много копий каждого гена, значительно облегчали этот процесс. С середины семидесятых годов методы гибридизации ш я!п были распространены на геном человека. Первоначально этот метод использовали для картирования тандемных повторяющихся последовательностей ДНК, например для генов рнбосомной РНК. В последнее время гибридизацию зп я!и удалось применить и для картирования уникальных генов человека. Принцип этого метода прост. Рассмотрим его на конкретном примере картирования некоего фрагмента ДНК человека величиной 14,9 т. п. н., клонированного на фаговом векторе.
Функция этого фрагмента ДНК не ясна. Известно, что он присутствует в количестве не более одной-двух копий на гаплоидный геном. Метафазные хромосомы человека, распределенные на стандартном предметном стекле, обрабатывали с целью удаления примесей связанной РНК и денатурации хромосомной ДНК. В качестве зонда использовали клонированный фрагмен~ ДНК, радиоактивно меченный 1~Н) с помощью ник-трансляции. Пред- Ряс. 18.19. Распределе- ние метки среди хро- мосом человека после гибридизации ш я!п мегафазных хромосом с клоннровавным фрагментом ДНК ве- личиной 14,9 т.п.н., ме- ченным тритяем.
Боль- шая часть метки связывается с концевой областью короткого плеча хромосомы !. (По Нагрег М.Е., уаиаегз С.Г., !981 Свгошозоша, 83, 431 — 439.) й' ~ Й г з !ввв6 Ю ййй !й) й8 лк Ю Экспрессия генетического материала Таблица 18.5. Результаты гибридизации фрагмента человеческой ДНК (14,9 т.п.н,) с метафазными хромосомами человека Ковдситрв- ди» зонды (мяту из«] Число после- Клетки в гибри- Общее число Число точек доввнвых дизуюшейс» точек ив ыв 1рзб клеток 1рзб хромосоме Коикурируюшвя ДНК !илы РНК«] 7 (33%) 8 (62%] 12(60%] 9(53%) 7 (70%) 8 (21%) 8 (13%) 18 (27%) 13(25%) '! (23%] Повторяющаяся ДНК 21 13 20 !7 10 38 61 66 53 31 тРНК Е.соб Повторяющаяся ДНК Повторяющаяся ДНК * Ковкурируюшвя ДНК (или РНК) добавлена в тысячекрвтиом избытке по отисшевию к зоилу.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
