Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 69
Текст из файла (страница 69)
Как показано на рис. 18.10, были идентифицированы две клеточные линии, у которых фрагмент хромосомы 10 был транслоцирован на хромосому 17 или 21. Кроме того, у исследуемых клеток была сохранена и исходная хромосома 10. Линия с транслокацией 1012! характеризуется уровнем активности ООТ, сравнимым с таковым в контрольной Рис. !8.8. Расположение гена АСР! в полосе 2р23.
Верхняя стрелка указывает место раз- рыва при делеции, и результате которой со- храняется активность фосфатазы 1 1см. рис. 18.7). Нижняя стрелка указывает место разрыва, при котором больной утрачивает эту активность. Локус АСР! расположен между этими двумя точками разрывов. Экспрессия генетического материала Рнс.
18.9. Трапслокация между хромосомами человека Х н 14. А. Две нормальные хромосомы. Б. Трапслоцированные хромосомы. 1По Калке Р, Н., Сгеадап К.Р., 1975. Аппп. Кец Сепег., 9, 407 — 486.) 18. Генетика соматических клеток: картирование генома 303 три фибробластнме линии клеток Хромосома Наблюпаем активность фермента Ожидаемая активность фермента линии, которая имеет две нормальные хромосомы и не имеет дуплицированных сегментов. Линия с транслокацией 10/17 характеризуется уровнем активности ООТ, примерно на 50% ббльшим, чем у других линий.
Вот почему предполагают, что линия с транслокацией 1О/17 содержит три копии гена ООТ. Этот ген должен быть локализован на сегменте хромосомы 10, присутствующем в транслокации 1О/17, но не 10/21 (рис. 18.11). 4 Р 1 1 к — л Š— — В Рис. !8.10. Хромосомный состав трех кле- точных линий. Ожидаемая ферментативная активность в линиях, изображенных в левом и среднем столбцах совпала со средними экспериментальными значениями.
У линии, Рис. ! 8.11 Расположе- ние гена СОТ в полосе 10024,3 десятой хромо- сомы. Места разрыва цри транслокациях по- казаны стрелками. Верхняя стрелка указы- вает место транслока- ции !О/17, а ниж- няя — 1О/2! !см, рис. !8.10). Локус СОТ расположен между эти- ми двумя точками раз- рыва. изображенной в правом столбце, уровень ак- тивности превышал значения, полученные лля других линий на 505к На этом основа- нии можно предположить, что данная кле- точная линия содержит три гена СОТ. Экспрессия генетического материала Микроклетки и изолированные хромосомы Селекция по типу НАТ и другие способы позволяют получать стабильные клеточные линии, несущие индивидуальные человеческие хромосомы. Существуют более прямые методы, позволяющие получать гибридные клеточные линии, содержащие определенные компоненты генома человека.
Это гибридизация клеток мыши с микроклетками человека, несущими неполный геном, и эндоцитоз мышиными клетками изолированных хромосом человека. Микроклетки представляют собой хромосомы, окруженные участками ядерной и плазматической мембран. При росте клеток в присутствии колцемида через несколько дней ядро распадается на несколько микронуклеусов, каждый из которых содержит только одну или несколько хромосом (рис. 18.!2). Эти клетки обрабатывают цнтохалазином и центрифугируют. Таким образом, отделяется фракция микроклеток, которые представляют собой микронуклеусы, окруженные тонким слоем цитоплазмы, заключенной между ядерной и плазматической мембранами.
Цитологические методы позволяют определить, какие именно хромосомы содержат полученные микроклетки. Плазматическая мембрана сохраняет рецепторы для вируса Сендай, что позволяет проводить гибридизацию клеток мыши с полученными микроклетками, используя этот вирус. Образующиеся в результате гибридизации линии клеток несут определенные человеческие хромосомы. Гены человека, зкспрессирующиеся в полученных гибридных линиях, могут быть, таким образом, отнесены к определенным хромосомам. Препарат хромосом человека„не содержащий примеси клеток, может быть получен при соответствующей обработке, вскрывающей плазматическую и ядерную мембраны клетки. В семидесятых годах были разработаны методы фракционирования и проточной микрофлуориметрии, позволяющие осуществлять сортировку хромосом на фракции, содержащие индивидуальные хромосомы человека высокой чистоты (рис.
18.! 3). Когда свободные хромосомы добавляют к культивируемым клеткам мыши, то эти клетки могут захватывать целые хромосомы в процессе эндоцитоза. Внутри рецициентной клетки захваченные хромосомы обычно деградируют, распадаясь на фрагменты. Если такие фрагменты содержат центромерные области, то они могут поддерживаться как единое целое. Фрагменты, лишенные центромеры, могут транслоцироваться на мышиные хромосомы. В том и другом случае определенные человеческие гены будут зкспрессироваться в гибридных клетках (рис.
18.14). Встраивание фрагментов в хромосому мыши происходит с очень низкими частотами, от 10 ~ до 10 з на клетку. Встраиваемые фрагменты могут быть как очень мелкими, не видимыми в световой микроскоп, так н достаточно крупными, включая плечи хромосом и даже целые хромосомы. Такой перенос генетического материала от донора„сопровождающийся встраиванием в хромосомы реципиента, называется трансформацией (как у бактерий) илн трансфекцией. Картирование генов в определенных областях хромосом может быть произведено в том случае, если экспрессию изучаемого гена можно тестировать в трансформированной клетке, а встроенный фрагмент хромосомы идентифицируется цитологически.
При анализе трансфициро- 18. Генетика соматических клеток: картирование генома 305 Рис. 18,12. А. Клетки фибробластов человека, содержашие микронук- леусы. Б. Смесь кле- ток, микроклеток (яр- кие) и фрагментов ци- топлазмы. В. Нуклеусы, включающие одну или несколько хромосом, окруженные тонким слоем цито- плазмы и плазматиче- ской мембраной. При фильтрадии смеси, по- казанной на фото Б, через трехмикронный фильтр самые мелкие микроклетки вместе А с небольшими фраг- ментами (В) пито- плазмы удастся отде- лить от более крупных микроклеток и целых клеток. (По Мс(чей С.А., Вгоип К. Ь., 1980, Р1 (АБ, ()БА, 77, 5394-5398.) (19,21,22) 1,0 о бх 8о йц 805 8 и н 1,0 0,1 0,5 Задержка митоаа Выделение хромосом Релилиентная клетка мьлцн НРКТ Рис. !833.
Распределе- ние флуоресценции нормальных хромосом человека, полученное с помощью прибора, позволяющего разде- лить хромосомы на основе различий в уровне флуоресцен- ции. Числа над пиками обозначают номера хромосом человека. Удается получить фракции, содержащие одну-две индиви- дуальные хромосомы. (По Кейп Я.
К ет а!., 1979. Ргос, )ь)ат!. Асаб. Бс! Т)БА, 76, 5804 — 5808.) Рис. 18.14. Впервые перенос генов с по- мощью целых хромо- сом был использован для встраивания гене- тического материала китайского хомячка в клетки мыши. На рисунке клетки мыши содержат дефект в гене НРДТ. Трансформиро- ванные клетки мыши, выросшие на среде НАТ, должны содер- жать ген НРДТ хомяч- ка. (По К!оЬшсйег д.А,, ЯигЫ Р.
Н„1981. Аппп. Кет. Вюсйепт., 50, 533 †5.) Огносительньгй уровень Ь флуоресценции е Клетка кимйского хомячка 0!РКТ'! Клетка мыши,трансформированная геном НРКТ' китайского хомячка 18. Генетика соматических клеток: картироаание генома 307 Хромосома релиииеитиой клетки Образовавшиеся хромосомы В— 5С— Стабилизаиия В— Селектируемый теи !5О)- В— 5О— С— Клан Клон Клон 1 2 3 Хромосома доиориой клетки Рис. !8.15. Для картироваиия генов после траисфекции необходима цитологическая идентификации перенесенного фрагмента хромосомы а клетках, отобранных цо активности исследуемых генов.
В различных клеточных линиях могут находиться фрагменты разной длины. ванных фрагментов данной хромосомы, различающихся по величине, можно определить синтению и порядок генов, Естественно, это возможно тогда, когда гены, отсутствующие в малых фрагментах, выявляются при встраивании фрагментов большего размера (рис.
18.15). Кроме такого прямого подхода, порядок генов и их относительное сцепление можно изучать по частотам котрансйуормат!ии этих генов. Такие эксперименты сводятся к измерению частот совместного встраивания в геном одной клетки двух разных генов. Гены, кодирующие галактокиназу (ОА1.К), растворимую тимидинкиназу (ТК1), и проколлаген 1 (СО1.М), расположены в длинном плече хромосомы 17 (рис. !8.! 6). При исследовании линий, трансформированных по маркеру ТК1, определено, что частота котрансформации для бАЕК равна 19% (5 из 27 трансформантов). Для СОЕМ частота котрансформации с ТК! равна 74;; (20 иэ 27).
Отсюда следует, что ген ТК1 расположен на хромосоме 17 ближе к гену СО(.М, чем к бАЕК. Расстояния между генами могут быть рассчитаны в единицах переноса генов, опосредованного хромосо- , соьм, одск тк! ! — 26 едиииц — + — 26 едиииц Рис. 18.16. Карта сегмента хромосомы 17 человека, построенная по результа- там переноса генов в составе траислодированных фрагментов хромосомы. (По К!оби!сйег У.А., ЯитЫ!е Е.Н., !981.
Аццш йет. В!осЬет., 50, 533-534.) До- полнительные данные указывают иа то, что покус СОСМ находится вие фрагмента ОАьК вЂ” ТК!. Экспрессия гепегпического мапмриаяа 308 мами (ПГОХ). Расстояние в одну единицу соответствует частоте котрансформации в 99; . Тогда в этих единицах расстояние между генами ТК! и СОЕМ равно 100 — 74= 26, а между ТК! и БАЕК вЂ” 100 — 19 = 81, Сами по себе эти цифры ничего не говорят о взаимном расположении исследуемых генов, но данные о том, что ТК! иногда котрансформируется с САЕК, не захватывая СОЕМ, указывают на то, что порядок этих генов следующий: САЕК вЂ” ТК! — СОЕМ. Картирование генов с помощью ДНК-зондов Методы картирования генов, обсуждавшиеся в предыдущих разделах, были основаны на экспрессии изучаемых генов в культурах клеток.
Гены, кодирующие ферменты клеточного метаболизма, (табл. 18.2) и гены, кодирующие поверхностные антигены, такие, как белки главного комплекса гистосовместимости или антигены группы крови, удовлетворяют этому условию. Гены, не обладающие подобным фенотипическим проявлением, не могут быть картированы лишь с использованием описанных методов. Это ограничение удается преодолеть с помощью методов генной инженерии. При этом становится возможным картирование любых последовательностей ДНК, для которых можно получить соответствующий ДНК-зонд. Эти методы внесли поистине революционный переворот в генетический анализ гибридов соматических клеток.
Первое применение методов работы с рекомбинантными ДНК для картирования генов человека включало ДНК-гибридизацию в растворе. Таким образом, удалось картировать гены п- и 8-глобинов. Зонды, представляющие собой комплементарные ДНК (кДНК) этих генов, были получены с помощью обратной транскрипции очищенных и- и 8-глобиновых мРНК. Эти зонды в определенных условиях не взаимодействуют друг с другом или с глобиновыми генами мыши, но образуют стабильные дуплексы при отжиге с соответствующими последовательностями ДНК человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
