Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Комбинация трех четных или трех нечетных мутаций приводит к проявлению дикого фенотипа, например в комбинации ГСО ГС2 ГС4 или ГС1 ГСЗ ГС5. То есть три мутации, каждая из которых в паре с любой из двух других мутаций не приводит к взаимной супрессии, присутствуя одновременно в виде тройной комбинации, проявляют способность к внутригенной супрессии. Напротив, комбинации из одной четной и двух нечетнык или одной нечетной и двух четных мутаций приводит к проявлению мутантного фенотипа. Для объяснения этих явлений были выдвинуты следующие предположения. 1.
Исходная мутация ГСО представляет собой делецию или вставку одной нуклеотидной пары, Внутригенная супрессия ГСО достигается лри включении одной дополнительной нуклеотндной пары (если ГСΠ— деления) или при делеции одной нуклеотидной пары (если ГСΠ— вставка). 2. Считывание нуклеотидной последовательности при трансляции кода начинается в фиксированной точке гена и идет последовательно кодаи за кодоном. Поэтому удаление или включение одной нуклеотидной пары автоматически приводит к сдвигу рамки считывания.
При этом последующие нуклеотиды включаются в состав кодонов с измененным за счет сдвига смысловым значением. Это означает, что между кодонами, вероятно, нет «знаков препинания». Таким образом, профлавин относится к числу мутагенов, вызывающих сдвиг рамки. 3. При синтезе полипептидов основания считываются тройками, т.е. кодоны имеют триплетную природу. 4. Все или большая часть из 64 возможных триплетов кодируют какую- нибудь аминокислоту, то есть код действительно является вырожденным (более одного триплета кодируют одну и ту же аминокислоту).
Когда была выполнена работа, ни о существовании мРНК, ни о ее роли в процессе биосинтеза белка еще ничего не было известно. Однако на следующем примере можно продемонстрировать, как с помощью сформулированных выше постулатов удается интерпретировать свой- 12. Генеилгческий код ства, проявз)ясмые мутантом РСО н его производными. Пусть участку В-цистрона, в котором картируются мутация РСО и супрессирующне ее мутации, соответствует следующий фрагмент некоторой гипотетической последовательности мРНК: САП САЫ САП САП САП САП САН САН САЫ САП гП+ Левый триплет фиксирует рамку считывания таким образом, что данная последовательность кодирует пептид, состоящий из остатков гистндина Н)з — Н — Н)з... Теперь допустим.
что мутация РСО приводит к делеции А во втором кодоне; САП СЫС АЫС АЫС АЫС АЫС АЫС АЫС АЫС АЫ гПРСО Тогда, начиная со второго триплета, будет считываться совершенно иная аминокислотная последовательность. Если образовавшиеся после сдвига рамки кодоны будут не ловзелзе-кодонами, то будет синтезироваться некий, скорее всего нефункциональный, полипептид, в данном случае — Н — Ьеп — !1е — !!е... Вообще говоря, если бы код был невы- рожденным, то сдвиг рамки в большинстве случаев приводил бы к возникновению лолзелзе-кодонов.
Далее предположим, что мутация РС1 соответствует включению дополнительного нуклеотида Ьг в четвертый кодон. Это приводит к восстановлению рамки считывания: САП СЫС АЫС АЫЫ САП САП САП САЫ САП САП гПРСО РС! Образующийся полнпептид будет отличаться от полипептида дикого типа тремя соседними аминокислотами и иметь последовательность Н — Ьеп — !!е — !!е — НВ.,. Если эти аминокислотные замены затронули относительно несущественный с точки зрения функции участок белка (что касается рассматриваемого участка В-цистрона, зто действительно так), то образующийся полипептнд может проявлять активность белка дикого типа.
Рекомбинационное расшепление РС1 и РСО позволяет получить матрицу РС1 САП САП САП САП !)СА ПСА ЫСА ЫСА ПСА ЫСА гПГС1 коднрующую полипептид, большая часть структуры которого Н!з— — Н!з — Н — Н — лег — Бег —... отличается от структуры белка дикого типа. Ясно, что при сочетании трех нуклеотидных делеций нли трех вставок на достаточно близком расстоянии друг от друга рамка считывания остается неизменной практически для всей матрицы.
Например, делеция второго, третьего и четвертого А приводит к следующей структуре мРНК: САП СЫС ПСЫ САП САЫ САП САП САП САП которая будет кодировать функциональный полипептнд НЫ вЂ” Ьеп — Бег— — Н — Н)з... Важнейшие выводы относительно природы генетического кода, сделанные на основании описанных экспериментов, позволили построить изящную, внутренне непротиворечивую модель. Сформулированные постулаты соответствовали полученным генетическим данным, однако ка- Экспрессия генетического материала залось, что их независимое экспериментальное подтверждение — дело далекого будущего. Ко всеобщему удивлению, потребовалось всего лишь пять лет для того, чтобы получить биохимические доказательства всех четырех постулатов и полностью расшифровать генетический код. Генетическое подтверждение существования терминаторных кодонов Изучение гП-мутаций предоставило также генетические свидетельства в пользу существования водопое, терминируюших синтез полипептидной цепи.
Комплементационный анализ показал, что цистроны А и В кодируют две различные генетические функции. Это значит, что на границе между этими цистронами должны находиться определенные генетические «знаки препинания». Делеция такого пограничного участка приводит к слиянию неделетированных участков А и В в один обший цистрон. Так, делеция 1589 (рис. !2.2) приводит к возникновению гПА- мутанта, сохраняющего, несмотря на частичную делецию в В-цистроне, его функциональность, т.е. способность кодировать активный В-белок.
Участок В-цистрона, исчезающий при делеции 1589, содержит ту самую область, в ко~орой картируются мутации РСО и ее производные. Это подтверждает сделанный в предыдущем разделе вывод о том, что данный участок В-белка не существен для проявления нормальной активности. Введение мутации со сдвигом рамки в неактивный А-участок слитых цистронов, образовавшихся в результате делеции 1589, нарушает и функциональную активность В-участка. Следовательно, слитая мРНК имеет направление трансляции А — В; считывание этой мРНК приводит к образованию одного слитого полипептида.
Аналоги нуклеиновых оснований, вызывающие мутации, отличные от сдвига рамки, также могут индуцировать такие мутации в А-участке «слитого» цистрона, которые влекут за собой потерю В-функции. Некоторые из этих мутаций, которые сводятся к замещению единичных нуклеотидов, принадлежат к классу супрессируемых летальных атЬег-мутаций (см, гл. 7). Возможное объяснение природы влияния атЬег-мутации в А-участке на экспрессию В-белка могло заключаться в том, что благодаря этой мутации возникает термннаторный кодаи, предотвращающий трансляцию В-участка слитой мРНК. Прямое свидетельство в пользу того, что атЬег-мутации вызывают преждевременную терминацию трансляции, было получено при иссле- кпв г1ГА деяевия Рис. !2.2 Делеция пограничного участка, расположенного между цистронами А и В гу-мутанта, удаляет последовательность, необходимую для независимой экспрессии двух различных генетических элементов, и приводит к образованию слитого А-В цистронв.
Отмечен размер участка, элиминируемого при лелеции 1589, 75 12. Генеглическцй код Муеялнл В272 Н32 В278 С!37 НЭ8 4489 С208 НЭЭ С!40 В17 фрагмент Н!1 Фрагмент С 140 Фрагмент 817 Фрагмент В272 Фрагмент Н32 Фрагмею В 278 Фрагмент С!37 Фрягмелт Н36 Фрегмелг А 489 Фрагмент Г 208 Полная молекула панне поллпептнлной лепя довании биосинтеза белка головки фага Т4. Десять алЭЬег-мутаций, картированных в различных участках гена, кодирующего белок фаговой головки, изучали, проводя инфекцию рестриктивного хозяина и оценивая для каждого мутанта величину транслируемого участка соответствующей мРНК.
Оказалось, что длина фрагмента белка фаговой головки, синтезируемого при абортнвной инфекции, точно коррелирует с поло- Рис. !2.3. Расположение на генетиче- ской карте десяти алэЬег-мутаций белка головки фага Т4. Внизу пока- зана длина полипептндов, синтезн- руемых прн абортивной инфекции хаждым нз соответствующих мутан- тов в клетхах рестрнктнвного хозя- ина. Длина полнпептндов непосред- ственно коррелирует с положением соответствующих мутаций на карте гена. Это подтверждает гипотезу, согласно которой амЬег-мутации обусловливают преждевременную терминацию белкового синтеза по мутантной мРНК-матраце.
(По 5агаЬсйа1 А. 5., 51гепол А. О. И'., Вгеплег 5., ВоИе А. !964. Магоге 201, !3.) Экспрессия генетического материала 76 жением каждой нз этих мутаций на карте соответствующего гена (рис. 12.3). Эти результаты свидетельствуют о том, что атбег-мутации действительно вызывают терминацию трансляции, а кроме того, они еще раз наглядно продемонстрировали правильность представления о колинеарности генов и полипептидов. Расшифровка кода с помощью биохимических методов Первым существенным вкладом биохимии в решение проблемы генетического кода явилась разработка системы бесклеточного синтеза белка ш ч(гго на базе белок-синтезирующего аппарата Е.
со(1. Синтез белка в этой системе, происходящий только в присутствии мРНК, регистрировался и оценивался по включению радиоактивных аминокислот в состав пептидов. Обычно в каждом данном эксперименте используют только одну радиоактивную аминокислоту, а остальные 19-нерадиоактивные. Таким образом, удается оценить возможность утилизации в системе одной определенной аминокислоты. В экспериментах с бесклеточной системой Маршалл Ниренберг н Генрих Маттэи, исследовавшие активность различных препаратов РНК в роли матриц для белкового синтеза, в качестве контроля использовали синтетическую полиуридиловую кислоту (ро!у Н), рассчитывая, что она не будет проявлять существенной матричной активности.
К своему большому удивлению, они обнаружили, что ро!у 13 достаточно эффективно направляет синтез полифеннлаланина. Более того, полифенилаланин оказался единственным полипептидом, синтезируемым в присутствии ро1у 1). Из этих наблюдений непосредственно вытекало, что триплет 1ЛЛ) служит кодоном для фенилаланина. Вскоре аналогичным образом было установлено, что ро!у С направляет синтез полипролина, а ро!у А-синтез полилизина, то есть ССС является пролиновым колоном, а ААА кодирует лизин. К счастью, использованная в этих экспериментах бесклеточная система содержала повышенную концентрацию ионов магния, при которой (как выяснилось в дальнейшем) инициация синтеза полипептидной цепи происходит и в отсутствие иннциаторного кодона А()О (см. гл.
11). Только поэтому вышеупомянутые синтетические матрицы и удавалось использовать в качестве субстратов для аномальной инициации трансляции. Так, отчасти благодаря счастливой случайности, были сделаны первые шаги на пути к полной расшифровке генетического кода Далее последовала серия экспериментов по изучению кодируюших свойств в бесклеточной системе статистических РНК-сополимеров. Такие сополнмеры можно синтезировать 1п чпго с помощью фермента полинуклеотид-фосфорилазы, используя в качестве субстратов 5'-рибонуклеозиддифосфаты.
Для работы этого фермента не требуется ни затравки, ни матрнцы,-полимеризация идет случайно за счет присоединения нуклеотидов к Зиконцу растущей цепи в соответствии с относительным содержанием различных 5'-рибонуклеозиддифосфатов в реакционной смеси. Так, если в реакционной смеси содержится А(УР и С!ЭР в соотношении 5:1, то образующийся сополимер также будет состоять из А и С в соотношении 5;1.
Распределение оснований каждого типа 77 !2. Генетический код Таблнаа 12.4. Частоты встречаемости различных кодоион в случайном сополимере состава А: С = 5: ! Нормализованная относительная частота Рассчитанная частота Состав колона ЗА 2А!С !А2С !2 ЗС в цели будет случайным, т.е. отвечающим только его относительному содержанию в смеси. Частота возникновения кодонов различного состава в случайном сополнмере с соотношением А:С=-5:1 может быть рассчитана (табл. 12,4). Расчет показывает, что на каждые 100 кодонов ААА в сополнмере должны присутствовать 60 кодонов типа 2А1С (ААС, АСА н САА) н так далее.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
