Айала, Кайгер - Современная генетика - т.2 (947305), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Зная генетический код (см. табл. 12Л), можно прямо по нуклеотидной последовательности ДНК читать аминокислотные последовательности соответствующих белков. На полученных с помощью электронного микроскопа фотографиях разрушенных клеток Е. сой можно видеть, что транскрипция, осуществляемая РНК-полимеразой, непосредственно сопровождается трансляцией образующейся мРНК (рис. 1!.! 2). Видно, как на синтезируемой цепи мРНК прямо по пятам за РНК-полимеразой, транскрибирующей ДНК, следуют рибосомы, осуществляющие синтез белка. РНК считывается в направлении 5' — 3' (точка роста находится на ЗсОН-конце цепи), поэтому инициация трансляции рибосомами может осуществляться на 1'-конце растущей цепи.
Та рибосомная частица, которая первой начала 11. Передача информации в клетках 55 трансляцию матрицы, изображенной на рис. 11.12, должна находиться ближе всех к месту расположения РНК-полимеразы. Анализ микрофотографий дополнительно подтверждает сделанные на основании более строгих экспериментов выводы о колинеарности последовательностей в генах и соответствующих полипептидах.
Колинеарность генов и полипептидов (',эукариоты) Гас! все Нм! МЬец РН! МЬ И Наещ (41) (116) (166) (306) (477) (603) (616) ~:~,1,~,.~, ~,~, т Пссвеиовешвьностн, ввонашие в состав мрия (виьонм) П(ммекуточнме (неконирумшие) учеспси ДНК (ннтронм) тьма и вер нуквеотннов (тнее Фнен кар)мане у нотки ЛНК Рис. !1.17. Карта структурной организации гена куриного овальбуыина с указанием участков, входящих в состав зрелой ыРНК, и разделяющих их иекодирующих участков последовательности ДНК. Каждый из пространственно разделенных кодн- рующих участков ДНК может быть идентифицирован по наличию сайта узнавания для одной из рестриктаз. Помечено положение инициаториого (А1)б) и терминаторного (11АА) кодонов.
(По Ртьяа(сеу)с А, е! а1, 1978, )ч)а(цге 274, 328.) Разработанные сравнительно недавно методы работы с рекомбинантными ДНК (обсуждаемые в гл. 9) позволили сравнить нуклеотидные последовательности индивидуальных мРНК, кодирующих некоторые известные эукариотические белки, с соответствующими фрагментами последовательностей в хромосомной ДНК. Благодаря использованию этих методов в 1977 г. было сделано сенсационное открытие. Оказалось, что внутри кодирующих областей некоторых эукариотических генов содержатся иетранслируемые фрагменты последовательности.
Так, некодирующие внутренние нуклеотидные последовательности были обнаружены в структурных генах ()-цепей кроличьих и мышиных гемоглобинов, легких цепей иммуноглобулинов и куриного овальбумина (основного компонента яичного белка). На сегодняшний день ясно, что наличие внутренних некодируюших последовательностей является типичным, хотя и не обязательным свойством эукариотических генов. На карте структурной организации гена овальбумина (рис. 11.17) показано, как семь протяженных внутренних некодируюших участков последовательности (интронов) разделяют смысловую последовательность, кодирующую зрелую мРНК, на восемь фрагментов (экэонов).
Экспрессия генетического материала Н С Ь 1 С А А 5 И Е Р С Е О У К Е Асьньсмхэсьмсснаньннссснэяссьснсььссэсьь Асосьсьсннс сс сссюссысссюссьсс сс ссьммиммхьнсэмсмсаьссн и 20 га ба бо и 10 во и )оа ))а )го К У Н Н А Е И 1 Р У С Р 1 А 1 И 5 А ! А И Ч У ! С А К О 5 Т В Т О ! И К Ч Ч А сьмсиссьссьэссмнсьсмсьосннсньснсссссьонсс нс мсэнь с кос сасмсьм сьсьссьссьсэсьсмьэмнмссоээса 130 !40 150 )ба )тс )ВО 190 гм мо мо ггю мо Е О К ! Р С Е 6 О 5 1 Е А С С С Т Ь У И У Н 5 5 ! К О ! 1 Н С 1 Т К Р Н О У У 6 СНОНСА ЬМСШ1ССАЭА С бАЭСАЮАООСМССНСАСН0ОС6САСАНСЭЭМССНОСАСЭЭСАСЧНАЭОАСЛОССХМССАМЭАССАЛАССЛМЮСМСОНЮАНЭ 250 260 гто 2ВО 290 )ОО 310 320 330 340 350 160 в ) ь ° л ! т ь е е н т Р ! ! Р к у ) О с ч к к ) т н с а ) е Р ! н Р о т ь мюсьасснюасскаэсьснюннсснсмсьсьсьэсссмюсснсссьсьмьсннссьсиснсисмсс спс А ак с сс асмссомсь с нсьмсьссюсс 370 )ва гпа 400 410 бгс 4)П мо 450 460 470 бна О О А я к ) 1 и 5 и ч е 5 о т н с 1 1 н н ч ) о Р я 5 ч О в о т А ю ч ) ч и ь АсАюсмсссАсАамснсмнмэссасссэсАААсосАсьсмАнссмюоьнсьскмнсюссчюсАассмсснссснссмнснсмьсюссмосснэнсаоньнкссш бнв ьас ма мо бга 5ЮО 550 мо 570 5ВО 590 бОО ч Р к с ! и е к А Р к ю к о т о А и Р Р к ч т е О к 5 к Р ч с у с ! с 1 Р н сансичсь ссксюсисс сь мсмн ьааьнамс смьсмссмосссэнсьоьсюаьсэьасмаьмссьмссиснасьэнсяиаэссьамнсаиюэээс 610 620 630 640 650 660 670 АВ0 ЛМ УОО т)о 720 Ч Ь В И А 5 Е К 1 ! Е А Я С Т 9 ! ! ! О Е У 6 С ) Е О 1 Е Е 1 АээсАнсмнсссэснсАсммнсмаьоссэсьссччссАэнсссмнссаАсмнсАссмсюнссчсснсооассюсАнсмсэнсьссссннаьссьссинсьсьсэн т)о тюо 750 760 710 Ува 79С ем ем нга Вгп ЕМ и Р к к ) т к и т в 5 и ч и е к я к ) к т К Е масмсэммкмс!сьсэмюссьссьсннсэмсэяюссмсьсьссььсмсмьснсэсчэссосссмсььсмссьссьммньсм ссюсьсмснснснэм ВМ Нба ВУО ЕЕО В90 90 О 910 920 5)о 940 95С 960 А н а 1 т О Р в в в А н )» с ! 5 в А е 5 1 к ! я с А ч н ь А н А к 1 н к ь с эсэнссасьнчмноьсшснюэсснаюосксссмнсос)нюаасмс эснсьссьсьсьсссосмэньно нсмсснснссмссьссьсмссмьмюсмюсмссьсс 57а Рна 990 1000 1010 1020 !агп 1040 1050 )Юбп !О70 )Пно Н Е У Ч С Ю А 5 А С Ч О А А Ь 5 Е Е Е Р 1 А А сьээсснасэссансмсьсииснссьаюссьосснсс с сисис смсьмнньсасс спесь ось насос нсоснь)смасьсмсссмссмссссаэсчсэ )сба 1100 1110 1120 1!10 1140 1!50 1160 1170 1)ВЮ 1190 1200 Р С й С Ч Ю Р счмассьакэчммссссна ммсмаьмсснсьммс с снсссюнссььсь с ссс аьссьс сэсэн м)п )мо )230 )гба оьа )мо )гтю )гво С Ь А СААМСОМС АХ С Н СЬ)КС )мо 1)СО ))М 1)га эсаасшммсснасьссюэмсньсммммнсьсмьсм с с аьсь с нс сьс нс«ю с Асьанььньсэснььсюсьюсээььасс нго 1)бо 1гьо 1гм )гто )гко ))бо мою М1с )юга )41о )мо ннь сааьмэммаакснсьс сэс сьснсмсьсьснсмммасмсснсьэсь сьссьаматэьисссааьммиссмссэссмннмсссьэимсиаэ ибо )4еа 1 ° тю !45О )оо )бэ )но )бо )5)а )ма )оа )ььо исмсмссэсиссьам кансьсхь мнснсисьаь н А ньнсмснсисьсс ьсс сс А сс сьсм ас сс нсннсюснснапнсснээсэсмаа 1640 1650 !660 )оа 16ВО )бта )ьго !5ВО 1590 )баа )Е)о )бга с с юссисьсэссньь иась нь мм осн Ан ь Оскс ннс ссснмьсн с ссомс ссс юань ми)со онсьмннснн чссн )бюо )тос )ию )Ум )710 174О )Убп )тм )ттс )тво )тм )вюо наньсссьюьхюмэсс)нююсюоь снссюсюннэ эс ю ААнсАОААюммАсА с и Асс 1510 )54О )вба )Рьо мтн )е)а )вга Вкратце рассмотрим те методы, которые позволяют получить изображенную на рис.
1!.!7 картину структурной организации гена. Сначала из полисом клеток куриного яйцевода, в котором овальбумин является основным синтезируемым белком, выделяют овальбуминовую мРНК, которая содержится там в значительном количестве копий. Эта Рис. 11.18. Последовательность куриной овальбумнновой мРНК. Остатки 13 †18 присутствовали в ДНК плазмнды РОЧ 230; остатки !†!2 н !731 †!872 были определены непосредственно по последовательности мРНК.
Звездочкой помечен овальбуминовый термннаторный кодаи. Зрелый овальбумин (в структуре которого отсутствует )л(-конце- вой (нннциаторный) метноннн) имеет сле- дующий амннокислотный состав; А1а(А)35, Агй(й) !5, Акп(Х)!7, Аяр(1))14, Сук(С)б, О!п((3) !5, С)1и(Е)33, С!17(П)19, НЫ(Н]7, 11е(1)25, Ееп(Е)32, Еук(К)20, Мег(М)!б, Р))е (Г)20, Рго(Р)!4, Бег(8)38, ТЬг(Т)15, Тгр(%)3, Туг(Ч)10, Ча!(Ч)31. Всего 385 остатков. (Мо4)й!Сб( соогсеку о( .),Р. Саиетй апс( В. и'. ВРМайеу, Ггощ 1. Мс. ВеувоЫЯ ег а!н Ха!иге 273, 723, 1978.) 57 Таблица 11.1.
Известные сайты узнавания лля рестриктаз в последовательности плазмиды рОЧ230, несущей встроенную овальбумииовую кДНК (остатки 13 — 1 872 иа рис. 11.18) Номера остатковз' Фсрмеити Узнаваемые после- довательности СТОСА(О ОО(СС О/АХТС ОСОТС ТСАСС АО/СТ Рзй Нас 111 НМН Ндп1 НРМ А(и! МЬо1! Е йп МЬо! Тад1 ХЬа! Яв)1 Роп11 Акп1 Мий " Отсутствуют сайты узнавания для рестриктаз Наеп, Н!пйп, Н(лйп), Нйо!, Нра!1, Есощ, Лоо1, Вам), Вай, Ввл!, зиш1, Хйо) и зад. " Приведеиы помора, саответствуюшие положеивю первого (5ч) иуклеотида в узнаваемой последовательиости, а ие точке расшеплепия.
Для случаев, когда распюплеиие происходит внутри узнаваемой последовательлости, положеиие соответствуюшей точки помечена косой чертой, (По Мс Яеупо(лк П ех а!. )978. Ыа)пге, 273, 723.) мРНК состоит из 1872 нуклеотидов, что значительно больше, чем необходимо для кодирования амннокислотной последовательности овальбумина. Овальбуминовая мРНК содержит транслируемый участок из 1158 нуклеотидов, заключенный между нетранслируемыми фланкирующими 5'- и 3'-участками, а также некодирующий «хвост» ро!уА на 3'-конце.
Двухспиральная ДНК-копия (кДНК) молекулы мРНК синтезируется )и и!)то с помощью обратной транскриптазы и после встраивания в подходящий плазмидный вектор клонируется в Е. со(й Полученная таким образом рекомбинантная плазмида рОЧ230 содержала в качестве вставки кДНК, соответствующую остаткам 13-1872 исходной мРНК. Была определена нуклеотидная последовательность кДНК- фрагмента гибридной плазмиды и составлена карта расположения на ней сайтов узнавания ферментами рестрикции. Соответствующая последовательность мРНК, выведенная из последовательности кДНК, показана на рис. 11.18, а список сайтов расщепления кДНК рестриктазами приведен в таблице 11.1.
Здесь существенно отметить, что в овальбуминовой кДНК отсутствуют сайты узнавания для рестрнктаз ЕсоИ и Н)идШ и имеется один сайт расщепления НаеП1 по остатку 818. После расщепления очищенной плазмиды рОЧ230 рестриктазами НтдП1 и Нас П1 кДНК можно отделить от плазмнцной ДНК в виде !1. Передача пнформа)(ии в клетках 477 818 258, 566, !458, 1732 1125 60, 336, 1605 15, 38, 117, Л5, 277. 475, 495, 557, 759, 828, 986, 1042, 1235, !332, 1338, !554 147, 308, 389, 603, 638, 748, 887, 895, 922, 989, 1030, 1133, 1161, 1197, 1229, 1669 193, 213, 254, 507, 754 482, 751, 898 41 1345 116, 494 474 867 325, 444, 447, 892, 9!4, 929, 943, 1014, 1085, 1103, 1159 ОААОА или ТСТТС 7СС( )ОО /ОАТС Т/СОА Т/СТАОА ОАОСТ/С САО7СТО О/ОАСС ССТО или ОАОО !!.
Передача информаиии в клетках 59 м о л ге г о о о 9,5 глл.~ 4,2 тлЯ.— Ф 2,4 глл.—, 1,8 тля. — ~ Рис. 11.20. Изображение радиоавто- граммы, полученной после расщепле- ния суммарной куриной ДИК ре- стриктазой Евой 1, электрофоретиче- ского разделения в агарозиом геле, переноса по Сауэерну н гибридиза- ции с радиоактивными зондами, по- лученными на основе фрагментов ОЧ~ н ОЧк по отдельности и в сме- си. (По Гл! Е.
ег а!. !978. Ргос. 1чаг, Асад. Ес1. ()ЕА 78, 2205.) или иному из двух кДНК-зондов (рис. ! 1.20). Это может означать только то, что в истинный овальбуминовый ген входят участки последовательности, содержащие сайты узнавания для ЕсоК1, которые не включаются в последовательность мРНК. Эти четыре ЕсоК1-фрагмента отмечены на карте (рис. 11.17), построенной на основе серии аналогичных экспериментов с использованием набора различных рестриктаз для расщепления и сопоставления куриной геномной ДНК и овальбуминовой кДНК. До того как было открыто существование интронов, процесс образования цитоплазматических мРНК представлялся достаточно неясным.
Биохимические исследования ядерной РНК показали, что в ее состав входят молекулы значительно большего размера, чем молекулы цитоплазматических мРНК. РНК этого типа называется гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Было обнаружено, что большая часть гяРНК не попадает в цитоплазму, а подвергается деградации до нуклеотидов непосредственно в ядре. С помощью биохимических методов не удавалось установить, синтезируются ли в ядре молекулы мРНК в том виде, в котором они обнаруживаются в цитоплазме. Можно было предположить, что в ядре их не удается обнаружить просто из-за большого избытка гяРНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
