Диссертация (1174241), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Большие группы, включавшие по 10 или 20 голов, формировались в том случае, когда в процессевыполнения эксперимента требовалась сепарация животных или тогда, когдаопыт предусматривал высокую экспериментальную убыль лабораторных животных (при проведении острого токсикологического эксперимента).Все болезненные процедуры, а также эвтаназия проводилась в условиях обезболивания.
Для эвтаназии использовался эфирный наркоз.392.3 Методы изучения острой и хронической токсичности, использованные в работеАХ-554 в виде фармацевтической субстанции вводили животным однократно внутрижелудочно и внутрибрюшинно. Контрольным группам животных вводиться растворитель: для внутрижелудочного введения –2% крахмальный гель, для внутрибрюшинного – физиологический 0,9% раствор хлорида натрия.
На 15 сутки после введения осуществлялась некропсия животных. Каждая группа состояла из 6 особей. Исследование проводилось насамцах и самках беспородных лабораторных крыс и мышей.При изучении острой токсичности дозы исследуемого вещества подбирались таким образом, чтобы определить дозу, не вызывающую гибель животных; дозу, вызывающую 100% летальность, и дозу вызывающую летальность, не достигающую 100%. Полученные дозы, позволяют рассчитать показатели ЛД50, ЛД90и ЛД10 при помощи пробит-анализа (метод Finney) [117,118]. Максимальная доза для изучения – доза максимально возможная дляданного пути введения.В течение первого часа после введения соединения и далее ежедневно(утром и вечером) в течение 14 суток после введения фармацевтической субстанции АХ-554 осуществляли контроль за общим состоянием и внешнимвидом экспериментальных животных.Регистрация массы тела животных проводилась непосредственно передвведением изучаемого вещества, далее – ежедневно в течение 14 дней.
Клинический осмотр для выявления отклонений в состоянии здоровья проводилив течение первого часа после введения соединения и далее ежедневно (утроми вечером) в течение 14 суток после введения фармацевтической субстанции.Оценивали спонтанное поведение животных в клетке: регистрироваться наличие признаков угнетения или возбуждения центральной нервной системы,судороги, тремор.
Состояние сердечно-сосудистой системы оценивали с ис-40пользованием электрокардиографа«Поли-Спектр-8/В» производства ООО«Нейрософт» (Россия) во II стандартном отведении.Измерение АД осуществляли с использованием системы неинвазивногоизмерения кровяного давления у грызунов CODA-HT4 «Kent ScientificCorporation» (США).Регистрация электрокардиограмм и измерение АД проводили до момента начала введения АХ-554, через 1 и 3 месяца после началавведения.Влияние на функциональное состояние центральной нервной системыизучили в тесте «открытое поле» с помощью компьютеризированной системы «Открытое поле» (ООО «Открытая наука», Россия) с возможностью осуществления видеорегистрации поведенческой активности грызунов и проведения последующего компьютерного анализа с использованием программного обеспечения того же производителя.Регистрация спонтанной двигательной активности в тесте «открытоеполе» проводилась до момента начала введения АХ-554, через 1 и 3 месяцапосле начала введения, при этом предметом исследования служили такие показатели, как пересечение квадратов, вертикальная активность, груминг, число заглядываний в норки и количество дефекаций [119].Исследование влияния АХ-554 на некоторые показатели системы свертывания крови проводили через 3 месяца после начала введения АХ-554: образцы крови животных (около 2мл) собрали в пробирки, содержащие растворцитрата натрия (3,8%), и центрифугировали для получения плазмы.Определяли следующие показатели: активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), и уровень фибриногена на автоматическом анализаторе показателей гемостаза АПГ2-02-П сиспользованием набора диагностических систем производства «Ренам» (Россия).412.4 Методы изучения противоопухолевой активности вещества АХ-554Метод исследования диапазона терапевтических доз АХ-554, рекомендованных для дальнейшего исследованияОпределение диапазона терапевтических доз было проведено на модели карциномы легкого Lewis (LLC) на линейных иммунодефицитных мышахсамцах С57Вl/6 весом 18-20 г в соответствие с актуальными методическимиуказаниями [112, 120].Животным подкожно перевивается взвесь опухолевых клеток LLC вобласть бедра задней лапки слева в количестве 1×106 клеток в растворе Хенкса (ООО «Биолот», Россия) [121].
Была использована опухолевая система изколлекции ФГБУ НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина Минздрава России.Были использованы дозы, составляющие 0,25%, 0,5%, 1%, 2,5%, 5%,7,5% и 10% от показателя ЛД50, определенного при внутрижелудочном введении мышам. Для каждой дозы определяется максимальный противоопухолевый эффект по индексу торможения роста опухоли (ТРО).Параметры, подлежащие регистрации. На основе анализа противоопухолевой активности субстанции АХ-554 в экспериментальной опухолевойсистеме in vivo с помощью анализа кривой доза – эффект (по значению универсального индекса ТРО) с помощью интерфейса «Биостат» рассчитали показатели ЭД20, ЭД50 и ЭД90.
При вычислении соотношения между соответствующими летальными и эффективными дозами были определены численныезначения терапевтических индексов (ТИ).Метод определения эффективной концентрации АХ-554Исследование эффективных концентраций ФС было определено вкультуре клеток немелкоклеточного рака легких A549/ATCC при их инкубировании в среде с добавлением АХ-554 в виде фармацевтической субстанциив не менее, чем семи концентрациях: 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 М.42Опухоль из банка опухолевых штаммов ФГБУ «НМИЦ онкологии им.Н.Н. Блохина» Минздрава России, полученную от мыши-акцептора клетокA549/ATCC на 21-е стуки после инокуляции штамма, механически измельчали и помещали в 0,25% раствор трипсина на 20 минут для разобщения клеток.
Затем ткань промывали в фосфатно-солевом буфере и суспензировали впитательной среде (92,5% базальная среда + 5% эмбриональная телячья сыворотка + 2% добавка В27) и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3минут. Суспензию раскапывали на матрицы и инкубировали в течение 2 часов, затем в каждую культуру добавляли 1,5 мл питательной среды. Плотность клеток составляла 9000 кл./мм2. Жизнеспособность культуры клетокподдерживали с помощью СО2-инкубатора (MCO-19AIC “SANYO”, Корея)при температуре 35,5 0С и 5% СО2.Субстанцию вещества добавляли сразу после инкубации в 1 мл полнойсреды для культивирования в выше указанных концентрациях.
Через 48 часов определяли жизнеспособность клеток по активности ЛДГ в среде культивирования в соответствии с инструкцией производителя (ЛДГ-2, «ОльвексДиагностикум», Россия).Показатели, подлежащие регистрации: Активность ЛДГ в среде культивирования через 48 часов после добавления в культуру соединения АХ554, от показателя в контроле, взятого за 100%.ЭК20, ЭК50и ЭК90– расчетныеконцентрации, вызывающие гибель 20%, 50% и 90% клеточной популяции вкультуре соответственно.Исследование ФС на модели карциномы легкого Lewis (LLC)Противоопухолевая активность АХ-554 на модели карциномы легкогоLewis оценивалась в сингенной опухолевой системе – карциноме легкогоЛьюис (LLC) на линейных иммунодефицитных мышах-самцах С57Вl/6 весом18-20 г, которым подкожно перевивалась взвесь опухолевых клеток LLC вобласть бедра задней лапки слева в количестве 1×106 клеток в растворе Хенкса (ООО «Биолот», Россия) [121].
Была использована опухолевая система из43коллекции ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.АХ-554 вводили внутрижелудочно через зонд ежедневно, начиная с 7-х сутокпосле перевивки опухоли, в сравнении с референтными противоопухолевымилекарственными средствами с доказанной противоопухолевой активностьюпри немелкоклеточном раке легкого – противоопухолевым антибиотикомдоксорубицином и препаратом платины цисплатином, рекомендуемым длялечения злокачественных новообразований легких в средне-терапевтической(СТД), минимально-действующей (МДД) и высшей терапевтической (ВТД)дозах [112, 120].
Антибластомный эффект вещества АХ-554 и его антиметастатическое действие оценивали в соответствии с «Методическими рекомендациями по доклиническому изучению противоопухолевой активности лекарственных средств»[112] и “Методическими рекомендациями по доклиническому изучению средств, обладающих способностью ингибировать процесс метастазирования и повышать эффективность цитостатической терапиизлокачественных опухолей” [120].Противоопухолевый эффект оценивали по объему первичного опухолевого узла и в конце эксперимента – по его массе.
Размеры опухолей наместе трансплантации определяли с помощью электронного штангенциркуляи рассчитывали их объем по известным формулам [120]. Для универсальнойоценки антибластомного эффекта пользовались вычислением индекса ТРО(см. выше), который рассчитывали в динамике канцерогенеза – на 1, 7 и 14день после прекращения внутрижелудочного введения изучаемого веществаили введения референтного противоопухолевого лекарственного средства.Количество метастазов в легких подсчитывается после фиксации их врастворе Карнуа с помощью бинокулярной лупы МБС-9 при увеличении 8х2.Влияние субстанции на продолжительность жизни животных с карциномой легкого Lewis оценивается на мышах, наблюдение за которыми осуществляется до их гибели (в данную группу включали 50% мышей, первоначально введенных в эксперимент).442.5 Методы исследования аллергизирующего и иммунотоксическогодействия АХ-554Выбор тест-систем, используемых в исследовании, определялся требованиями, изложенными в методических рекомендациях, и международнойпрактикой генотоксикологических исследований [122, 123].
Тесты являютсянаиболее верифицированными и широко используемыми в экспертных и научных исследованиях генотоксичности синтетических и природных соединений. Исследование включало в себя изучение аллергизирующих свойств лекарственного вещества на морских свинках и мышах.При этом, оценка аллергизирующего действия фармацевтической субстанции АХ-554 проводилась с использованием следующих моделей и методов: оценка анафилактогенной активности на морских свинках; реакция общей системной анафилаксии, реакция активной кожной анафилаксии; реакция гиперчувствительности немедленного типа (ГНТ) и реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на морских свинках при эпикутанномнанесении вещества; реакция гиперчувствительности немедленного типа(ГНТ) и реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на морскихсвинках при конъюнктивальном нанесении вещества; реакция гиперчувствительности замедленного типа на мышах.Тесты in vitro на модели реакции ГЗТ у морских свинок при внутрикожном введении субстанции: реакция специфического лизиса лейкоцитов(РСЛЛ), определение количества эозинофилов, влияние на фагоцитарную активность нейтрофилов (НСТ-тест).В настоящем исследовании в рамках изучения иммунотропных свойстввещества оценивали способность АХ-554 влиять на уровень гемагглютининов в сыворотке крови экспериментальных животных.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
