Диссертация (1174241), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Иммунологическаясуть проводимой реакции заключается в агглютинации антителами иммунизированного организма животного антигенов, в качестве которых выступаютэритроциты барана (ЭБ).45Через 1 час после введения фармацевтической субстанции мышамвнутрижелудочновводили0,5 мл суспензии трижды отмытых в стерильном0,9% растворе натрия хлорида эритроцитов барана (ЭБ) в дозе, равной5х108 ЭБ/мл.
Через 7 дней после иммунизации животные выводились из эксперимента, забиралась кровь для получения сыворотки. Для инактивациикомплемента сыворотка прогревалась при температуре 56 оС в течение 30мин.Определение титра гемагглютинов проводилив микротитраторе «Такачи ОХ-603/1». Титр антител (наибольшее разведение сыворотки, при которомнаблюдается отчётливая агглютинация ЭБ) выражали величиной log2T, где Т– титр антител исследуемой сыворотки.Реакция гемолиза позволяет сыворотке от иммунизированных животных в присутствии комплемента морской свинки вызывать гемолиз ЭБ, внесенных в инкубационную среду. Определение титра гемолизинов также проводили в микротитраторе «Такачи ОХ-603/1». Наибольшее разведение исследуемой сыворотки, при котором наблюдали отчетливый гемолиз эритроцитовбарана, принимали за титр лизинов и выражали величиной log2T.Реакция гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) ставилась поокончании введения препарата.
Мыши были иммунизированы внутрижелудочно 0,5 мл эритроцитов барана (5 х 108 клеток). Разрешающая доза антигена (108 эритроцитов барана в 0,05 мл физиологического раствора) вводилась на 5 сутки под апоневроз подушечки задней лапы (То). В контралатеральную лапу (контрольная Тк) вводили в том же объеме изотонический раствор натрия хлорида.
Толщину лап измеряли в мм на уровне подушечки инженерным микрометром МК-025. Индекс реакции ГЗТ определяли через 24часа по разнице толщины опытной и контрольной лап.Оценка влияния АХ-554 на неспецифический иммунитет проведена спомощью НСТ-теста, характеризующего фагоцитарную (бактерицидную) активность нейтрофилов крови.
Для постановки реакции НСТ в настоящем исследовании использован метод R.E.Schopf с соавт. [121].462.6 Методы исследования мутагенного действия АХ-554Мутагенное действие АХ-554 при внутрижелудочном введении былоизучено в тесте Salmonella/микросомы (тест Эймса).В качестве тест-объектаиспользовали Salmonella typhimurium – штаммы ТА 97, ТА 98 и ТА 100, полученные из Всероссийской Коллекции Промышленных МикроорганизмовФГУПГосНИИГенетика.
Тест Эймса проводили с системной метаболической активацией и без таковой на основании сопоставления количества спонтанных и индуцированных ревертантных колоний. Для метаболической активации использовали фракция S9 печени самцов крыс, которым за 5 дней дозабоя вводили индуктор микросомальных ферментов совол (300 мг/кг, однократно, внутрижелудочно). Для вариантов без активации использовали 9аминоакридин – 50 мкг/чашку для штамма ТА 97, 2-нитрофлуорен – 5 мкг начашку для штамма ТА 98, азид натрия – 10 мкг на чашку для штамма ТА 100.В качестве негативного контроля была использована стерильная вода (0,1 млна чашку).Кроме того, мутагенную безопасность производного хромена определяли на основе подсчета хромосомных аберраций в цитогенетическомтесте на клетках костного мозга мышей [124].2.7 Метод исследования канцерогенности АХ-554Для выявления и количественной оценки способности субстанции АХ554 индуцировать ДНК-повреждения в различных органах и тканях млекопитающих проводили оценку его канцерогенного потенциала методом ДНКкомет.В качестве позитивного контроля вводили генотоксикант метилметансульфонат в дозе 40 мг/кг.
Исследуемое вещество вводили внутрижелудочно.Метод ДНК-комет проводили в щелочной версии в соответствии с рекомендациями [125].47Выведениеживотныхосуществлялиподэфирнымнаркозомсмещением шейных позвонков через 3 часа и 18 часов после введения АХ554.ИзображенияДНК-кометанализировалисиспользованиемпрограммного обеспечения CASP 1.2.2на эпифлуоресцентном микроскопеМикмед-2 12T («Ломо», Россия), совмещенном с цифровой камеройвысокого разрешения (VEC-335, «ЭВС», Россия), при увеличении x200. ВкачествепоказателяповрежденностиДНКиспользовалипроцентноесодержание ДНК в хвосте ДНК-комет (%ДНК в хвосте). С каждогомикропрепарата анализировали не менее 100 клеток.
Полученные показателисравнивали с показателем для негативного (растворитель) контроля.2.8 Методы исследования влияния АХ-554 на репродуктивную сферуПо окончании введения АХ-554 самок подсаживали к интактным самцам в соотношении 2:1 на 10 дней (2 эстральных цикла). Во время исследования следили за общим физическим состоянием и поведением животных.Крыс взвешивали до начала исследования, по окончании введения фармакологического вещества и перед эвтаназией на 20-й день беременности.
Первым возможным днем беременности считали день подсадки самок к самцам.У половины группы (по 10 самок из каждой группы, отобранных случайным образом) исследовали состояние репродуктивных органов на 20 деньбеременности — в яичниках подсчитывали число желтых тел, в матке —мест имплантаций, живых и мертвых плодов.
На основании полученных данных вычисляли показатель предимплантационной гибели эмбрионов, который представляет разность между количеством желтых тел и мест имплантаций, отнесенную к числу желтых тел, принятых за 100 %. Определяли показатель постимплантационной гибели, который представляет разность междучислом мест имплантаций и живых плодов, отнесенную к числу мест имплантаций, принятых за 100 %. Кроме того, вычисляли индекс фертильности48— отношение числа беременных самок к числу подсаженных. Второю половину группы беременных самок, получающих АХ-554, оставляли до родов ив течение одного месяца наблюдали за развитием потомства, регистрировалиобщее физическое состояние и поведение, динамику массы и гибель крысят.О состоянии репродуктивной функции самцов судили по количествуживых и мертвых плодов в репродуктивных органах самок, спаренных с самцами, получавшими АХ-554.Эксперименты по изучению репродуктивной токсичности были проводиться на беременных крысах.
АХ-554 вводили внутрижелудочно ежедневнос 5 по 19 дни беременности. Контрольной группе животных (группа 1) вводили растворитель. На 20 сутки беременных самок подвергали эвтаназии подэфирным наркозом и вскрытию с целью оценки эмбриотоксического влиянияАХ-554. Извлеченные плоды взвешивали, и определяли их краниокаудальные размеры. Висцеральное исследование органов плодов проводили поСтейплсу [126]. После исследования состояния внутренних органов проводили изучение состояния скелета плодов модифицированным методом Доусонапутем окрашивания ализарином [127].Вскоре после рождения крысят потомства F1 генерации, но не раньше24 часов после него, производили оценка их постнатального развития, аименно: общее наблюдение за физическим развитием потомства, изучениесозреваниясенсорно-двигательныхрефлексовиэмоционально-двигательного поведения. Регистрировали размер помета, число живых имертвых новорожденных, массу тела.
Отмечали сроки отлипания ушных раковин, появления первичного волосяного покрова, прорезывания резцов иоткрытия глаз.Проводили изучение созревания сенсорно-двигательных рефлексов иэмоционально-двигательного поведения. В обеих группах потомства проводили тесты на различных сроках постнатального развития, соответствующихсреднему времени формирования рефлексов – изучали отрицательный гео-49таксис, маятниковый рефлекс, переворачивание на плоскости, обонятельнуюреакцию и поведенческие реакции в тесте «открытое поле».2.9 Методы статистического анализа полученных экспериментальныхданныхСтатистический анализ полученных экспериментальных данных проводили методами вариационной статистики с использованием пакета программ «Биостат» (Россия). При анализе различий в абсолютном размере изучаемого явления использовали непараметрические критерии (в зависимостиот объема групп применяли точный критерий Фишера или критерий «Хиквадрат»).
При анализе различий средних или относительных величин, вычисленных при регистрации измеряемых параметров, использовали параметрические критерии сравнения 3 и более совокупностей (Ньюмена-Кейлса,Даннета) после проверки нормальности распределения с помощью одномерного дисперсионного анализа (ANOVA). Также применяли функциональныевозможности U-критерия Манну-Уитни для независимых выборок.При анализе динамики летальности мышей в опытах с экспериментальным канцерогенезом, строили кривую выживаемости, прогноз продолжительности жизни осуществляли при помощи критерия Гехана с поправкойЙейтса [128, 129].50ГЛАВА 3.ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОИЗВОДНОГОХРОМЕНА ВЕЩЕСТВА АХ-5543.1 Острая токсичность АХ-554 при различных путях введенияПри изучении острой токсичности дозы исследуемого вещества подбирались таким образом, чтобы определить дозу, не вызывающую гибельживотных; дозу, вызывающую 100% смертность, и дозу вызывающую смертность, не достигающую 100%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
