Диссертация (1174217), страница 11
Текст из файла (страница 11)
приложение 1, стр. 205). Данная анкета выявляет минимальныепсихо-эмоциональные расстройства и используется для определения качестважизни, связанного со здоровьем; была разработана специально для непсихическихзаболеваний [155], чувствительна к изменяющимся симптомам, и широкоприменяется в клинической практике [362]. Качество жизни оценивалось по 4основнымгруппампараметров:положительныеэмоциональныереакции;тревожность, нервозность; социальная и физическая активность; депрессия.55Производилось суммирование баллов по каждой группе вопросов и в целом,наименьший балл соответствует наилучшим показателям качества жизни.Ультразвуковое исследование органов малого таза выполнено сиспользованием прибора Ultrasоund Scanner Type 2012 ADI The Panther фирмыB&K Medical (Великобритания), работающего в реальном масштабе времени;применялись трансабдоминальный датчик 3.5 мГц и трансвагинальный датчик 57,5 мГц.
В ходе исследования проводилась оценка положения и размеров матки,структуры миометрия; толщины, и структуры эндометрия (определение толщинысрединного М-эхо); размера и структуры яичников. Нормальным значением М-эходля I фазы менструального цикла у здоровых женщин считались 4-8 мм.
Объемяичников подсчитывался по формуле V (см3) = [продольный размер (см) Хпоперечный размер (см) Х толщина (см)] Х 0,479, где 0,479 – коэффициентпоправки на эллипсоидность. У менструирующих женщин исследованиепроводилось в I фазу естественного или медикаментозно индуцированного цикла.Биохимические показатели были определены при помощи автоматическогобиохимического анализатора «Roche Diagnostics Hitachi 912» («F.
Hoffman-LaRoche Ltd», Франция) по стандартной методике. Исследование содержания всыворотке крови общего холестерина (ХС), ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП, триглицеридов(ТГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), ионизированного кальция (Са++), фосфора (Р),гаммаглютамилтранспептидазы(ГГТП),аланинаминотрасферазы(АЛТ),аспартатаминотрасферазы (АСТ), ЛДГ проводилось при помощи стандартныхнаборов фирмы «Roche Diagnostics» (Швейцария).Забор крови производился натощак, в утренние часы (8-11 ч.), привенепункции локтевой вены.Референсные значения для биохимических показателей составили:• ХС 3,3-5,2 ммоль/л; ТГ 0,1-1,2 ммоль/л; ХС-ЛПНП 0-3,37 ммоль/л;ХС-ЛПВП 0,9-2,6 ммоль/л;• Са++ 1,03-1,29 ммоль/л; Р 0,87-1,45 ммоль/л;• ЩФ 0-270 Е/л; АЛТ 4-41 Е/л; АСТ 4-38 Е/л; ГГТП8-61 Е/л.Гормональные исследования: уровни эстрадиола, лютеинизирующегогормона (ЛГ) и фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), общего тестостерона56(Т), пролактина, тиреотропного гормона (ТТГ) и свободного тироксина (св.Т4)исследовались иммуноферментным методом при помощи анализатора «Immulite2000» («Diagnostic Products Corporation», США).
Определение концентрации ЛГ,ФСГ и половых стероидов у женщин из группы сравнения 1 проводилось на 5-7день менструального цикла. Определение содержания глобулина, связывающегополовые гормоны (ГСПГ) проводилось при помощи автоматического иммуннохимического флюориметрического анализатора Autodelfia («Wallac», Финляндия),ДГЭАС – иммунохимическим методом с электрохемилюминесцентной детекцией(ECLIA) при помощи анализатора «Cobas 6000» («Roche Diagnostics», Швейцария).Референсные значения для гормональных показателей составили:• ТТГ 0,25-3,5 мМЕ/мл;• св.Т4 9,0-20,0 пмоль/л;• ЛГo для репродуктивного периода 1,6-9,0 Ед/л;o для постменопаузального периода 14,2–52,3 Ед/л;• ФСГo для репродуктивного периода 2,4-9,3 Ед/л;o для постменопаузального периода 19,3-100,6 Ед/л;• Пролактинo для репродуктивного периода 90-540 мЕд/л;o для постменопаузального периода 73-390 мЕд/л;• Эстрадиолo для репродуктивного периода 97-592 пмоль/л;o для постменопаузального периода <110 пмоль/л;• Общий Т 0,2-2,7 нмоль/л;• ГСПГ 26,1-110,0 нмоль/л;• ДГЭАС 2680-9230 нмоль/л.Определение концентрации ЛГ, ФСГ и половых стероидов у женщин изгруппы сравнения 1 проводилось на 4-7 день менструального цикла.57Концентрации свободного тестостерона рассчитывали по формуле [356]:св.Т = ([T] – N[cв.T])/Kt{ГСПГ– [T] + N[cв.T]}, гдесв.Т – содержание свободного тестостерона в крови;T – содержание общего тестостерона в крови;N=КаСа+1; Ка – константа ассоциации альбумина с тестостероном (3,6х104л/моль); Са – концентрация альбумина (43 г/л);Kt – константа ассоциации ГСПГ с тестостероном (109 л/моль)ГСПГ – концентрация глобулина, связывающего половые гормоны.Магнитно-резонанснаятомография(МРТ)головногомозгасприцельным исследованием гипофиза проводилась на высокопольном аппарате«Intera Achieva» («Рhilips», Германия) со сверхсильной напряженностьюмагнитногополя3,0гадолинийсодержащихТ,свнутривеннымвведениемвнеклеточныхконтрастных препаратов, с толщиной среза 2 мм.Оценивали максимальный линейный размер в вертикальной, сагиттальной(переднезадней), и фронтальной (поперечной) плоскостях, единица измерения –миллиметр.
Исследование проводилось в положении лежа на спине безпредварительной подготовки.Денситометрическое исследование: содержание МПК в поясничныхпозвонках и проксимальной части бедра определяли на денситометре фирмы«Holodgic Discovery A» (США) методом двухэнергетической рентгеновскойабсорбциометрии. Оценку минеральной плотности кости проводили по Zкритерию и Т-критерию.Молекулярно-генетические исследования проведены 21 пациентке сцентральным гипогонадизмом на кафедре генетики биологического факультетаФГБОУ ВО МГУ им. М.И. Ломоносова.Выделение геномной ДНК из цельной венозной крови проводили, используянабор реактивов DNA Prep100 (DIAtom™) по рекомендованной изготовителемметодике.Полимеразная цепная реакция (ПЦР): подбор олигонуклеотидных праймеровосуществляли из данных нуклеотидной последовательности генов, приведенной вбазе данных NCBI (Амплификацию всех исследуемых фрагментов генов58проводили методом ПЦР).
Состав реакционной смеси (25мкл): 0,1 – 1,0 мкггеномной ДНК; по 0,125 мкМ каждого олигопраймера; по 200 мкМ каждогонуклеозидтрифосфата; 1,0 единицу активности Taq-полимеразы; буфер (67мМ TrisHCl; 16,6 мМ (NH)SO; 0.01%Twin-20; pH8,8).Олигонуклеотидныепраймерыбылисинтезированыметокси-фосфоамитидным методом в НПФ «Литех» и в Институте биоорганической химииим.М.М.Шемякина.ПоследовательностипраймеровиусловияПЦР,разработанные для выполнения данного исследования, приведены в приложении 2(стр.208).АнализполученныхПЦР-фрагментовосуществлялиметодомэлектрофореза в 2,5% агарозном и/или 8% полиакриламидном гелях (ПААГ) споследующей визуализацией в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.Метод SSCP-анализа.
Поиск мутаций в кодирующей последовательности иобластях экзон-интронных соединений гена FGFR1 осуществляли методом анализаконформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP-анализа) [270].Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ).Для анализа известных точечных мутаций в генах проводился ПЦР-ПДРФ анализс использованием эндонуклеаз рестрикции производства фирмы ООО «Сибэнзим»(Россия), приведенных в Таблице 7.Таблица 7 – Использованные эндонуклеазы рестрикцииСайтГен, экзонМутациярестрикцииЭндонуклеазарестрикцииGNRHR, 1экзонThr32Ile+BstMB1GNRHR, 1экзонArg139His-AccB71GNRHR, 3экзонCys279Tyr+BseI1FSHB, 3 экзонCys51Gly+KpnIЭлектрофорез в ПААГ.
Для оценки результатов рестрикции использовали 8%гель с соотношением акриламида и бисакриламида 29:1 [120]. Электрофорезпроводили при 15-18 В/см в течение 1-2 часов. В качестве маркера молекулярноговеса использовали ДНК фага λ, рестрицированную MspI. После разделения59фрагментов гель окрашивали в растворе бромистого этидия (0,1 мкг/мл в 1хТВЕ) втечение 5 минут.ОпределениенуклеотиднойпоследовательностиПЦР-фрагментовсвыявленной при SSCP-анализе измененной электрофоретической подвижностью,проводили методом прямого секвенирования ДНК с использованием прямого илиобратногопраймеров(см.приложение2,стр.210).Автоматическоесеквенирование проводилось согласно протоколу фирмы производителя припомощи генетического анализатора ABI Prism 3100 («Applied Biosystems», США).2.3Дизайн исследованияДизайн исследования был одобрен на заседании Межвузовского комитета поэтике (протокол № 02-14 от 27.02.2014).
Исследование состояло из двух этапов:одномоментного (поперечного) и длительного (продольного) проспективногоисследований.Первый этап – изучение клинических, биохимических и гормональныхособенностей пациенток с центральным женским гипогонадизмом в сравнении создоровыми женщинами разных возрастных групп. На этом этапе было обследовано536 пациенток молодого возраста с аменореей, из которых – согласно критериямвключения и исключения – было отобрано 176 женщин с подтвержденнымдиагнозом центрального гипогонадизма.
Кроме того, обследовано 73 здоровыхмолодых женщин и 86 здоровых женщин в естественной постменопаузе, изкоторых отобрано 53 и 58 женщин, соответственно, для групп сравнения.Пациенткам, включенным в группы, проводились следующие обследования:• Клинические:- Оценка имеющихся жалоб;- Определение роста, массы тела, АД и частоты сердечных сокращений;- Определение качества жизни при помощи опросника GHQ-28;• Лабораторные:- Биохимический анализ крови: холестерин, триглицериды, ХС-ЛПВП, ХСЛПНП, кальций ионизированный, фосфор, ЩФ;60- Гормональное обследование: ЛГ, ФСГ, пролактин, эстрадиол, общийтестостерон, ГСПГ, ТТГ, св.
Т4, ДГЭА-С;• Генетические исследования:- Количественная оценка экспрессии мРНК генов WDR11, DUSP6, PROK2,CHD7, GNRHR и GNRH1 (только пациенткам основной группы и группысравнения 1)- гены рецептора ГнРГ, FGFR1 (только пациенткам основной группы)• Инструментальные:- Остеоденситометрия: позвоночник, шейка бедра (только пациенткамосновной группы и группы сравнения 2),- УЗИ органов малого таза,- МРТ головного мозга (только пациенткам основной группы).Второй этап – проспективное исследование эффективности и безопасностигормонального лечения преждевременного старения у пациенток с центральнымженским гипогонадизмом.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
