Диссертация (1154536), страница 13
Текст из файла (страница 13)
После инкубации осаждали при 13 тыс.об./мин. 5 минут.Супернатант (150 мкл) переносили в чистые пробирки и добавляли 300 мклэкстрагирующего буфера (5 М гуанидинтиоцианат; 0,05 Мтрис-HCl pH 6,4; 0,02М Na2ЭДТАpH 8; 1,3% Triton X-100) и 35 мкл суспензии силики. Смесьинкубировали в термостате 5 минут при 55° С. После чего осаждали 30 секундпри 5 тыс.об./мин. и удаляли надосадочную жидкость. Промывку осуществляли75трехкратно с применением промывочного раствора (70 % этанол, 0,01 М ТрисHCl pH 8,0). Для элюции ДНК из сорбента добавляли к осадку очищенную воду(система очистки Millipore), инкубировали 5 минут при 55° С, центрифугировали13 тыс.об./мин.
5 минут и отбирали надосадочную жидкость.Выбор праймеров осуществляли в ходе предварительного скрининга сучетом точности детекции и воспроизводимости фингерпринтов. Для анализагенетической структуры популяций были выбраны три праймера:UBC-826: 5'-ACACACACACACACACC-3'IT1: 5'-CACACACACACACACAGT-3'IT2: 5'-CACACACACACACACAAC-3'Условия ПЦР оптимизировали с применением градиента температур втермоциклере MJ Mini (Bio-Rad, США).Амплификацию осуществляли в термоциклерах MJMini и MyCycler (Bio-Rad,США).Условия ПЦР. Реакцию проводили в 20мкл смеси, содержащей 20 нггеномной ДНК, 100 мМтрис-НСl (рН 8,3), 500 мМ КСl, 4 мМ MgCl, 0,25 dNTP, 0,5мМ праймера, 0.5 единиц Taq ДНК-полимеразы.ПЦР проводилась в следующих условиях:1.
начальная денатурация – 94°С, 3 мин;2. 30 циклов:- денатурация – 94° С, 30 секунд;- отжиг праймера – 54° С 30 секунд;- элонгация – 72° С 1 минута3. финальная элонгация – 72° С 5 минутПродукты ПЦР были разделены посредством электрофореза в 2% агарозномгеле с использованием ТАЕ буфера, при стабилизированном напряжении 120 В втечение 45-55 минут при комнатной температуре. Блоки окрашивали бромистымэтидием,послечегополучалиизображениепаттернов.Изображенияобрабатывались с помощью специального ПО GelAnalyser, разработанное76Скосыревым В.А. (Скосырев и др., 2005, 2006), опробированное в ИТЭБе РАН(Ломаева, 2007).По изображениям электрофореза составляли бинарные матрицы, гдеприсутствие полосы обозначалось как «1» (аллель p), отсутствие «0» (аллель q).У S.
ravergiensis было обнаружено 29 локусов: 8 локусов с использованиемпраймера UBC 826, 13 локусов с использованием праймера IT1, 8 локусов IT2(рис. 3.14).Рис. 3.14. ДНК-паттерны S. ravergiensis и их расшифровка(номерами обозначены первые и последние локусы).У B. cylindrica было обнаружено 44 локуса: 15 локусов с использованиемпраймера UBC 826, 17 локусов с использованием праймера IT1, 12 локусов IT2(рис.
3.15).77Рис. 3.15. ДНК-паттерны B. cylindrica и их расшифровка(номерами обозначены первые и последние локусы).У X. derbentina было обнаружено 35 локуса: 10 локусов с использованиемпраймера UBC 826, 13 локусов с использованием праймера IT1, 12 локусов IT2(рис. 3.16).78Рис. 3.16. ДНК-паттерны X. derbentina и их расшифровка(номерами обозначены первые и последние локусы).3.5.Статистическая обработка данныхОбработка результатов морфометрического анализаСтатистическому анализу предшествовал разведочный анализ данных, входе которого была проведена проверка нормальности распределения данных спомощью формального теста Шапиро-Уилка.
Большинство полученных данныхимело распределение, отличное от нормального (таблицы Приложения 1, 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9), в связи с чем для проверки статической значимости различий междугруппами применяли аналог однофакторного дисперсионного анализа ‒ тест79Краскала-Уоллиса(Kruskal,Wallis,1952).Дляустраненияэффектамножественных сравнений дальнейшие попарные сопоставления выборокпроводили с использованием теста Манна-Уитни-Уилкоксона (или Wilcoxon ranksum test) (Mann, Whitney, 1947) с поправкой по методу Холма (Holm, 1978).Для статистической обработки использовали стандартный пакет программы R(www.R-project.org, 2016).Обработка результатов анализа генетической структуры популяцийГраницы локусов определяли с помощью сопоставления эмпирическогораспределения генотипов с теоретически ожидаемым распределением по Харди–Вайнбергу с помощью критерия хи-квадрат Пирсона (таблицы Приложения 10,11, 12).Для оценки генетического полиморфизма вычисляли следующие стандартныепараметры:1) частота аллеля локуса (Животовский, 1991):=(21+2)2, =(23 +2 )2,(10)где p, q-частоты аллелей,N1, N2, N3 – численность в выборке особей соответствующих генотипов,N–общий объем выборки.2)среднее число аллелей Na, вычислялось как среднее арифметическое: = 1⁄ (∑=1 ),(11)где L–число исследуемых локусов,ni – число гетерозигот по i-му генотипу.3) эффективное число аллелей (Brown, Weir, 1983): =11−,(12)где He–ожидаемая гетерозиготность.4) индекс Шеннона (Brown, Weir, 1983):Н´ = − ∑ ln ,где pi – частота i-го аллеля.5) наблюдаемая гетерозиготность (Hartl, Clark, 1997):(13)80 =№ ,(14)где № He – число гетерозигот в выборке.6) ожидаемая гетерозиготность (Hartl, Clark, 1997): = 1 − ∑ 2 .(15)7) коэффициент инбридинга (Hartl, Clark, 1997): − = .8) процент полиморфных локусов в популяции P(%).Длясопоставленияпоказателей(16)генетическогоразнообразиямеждупопуляциями использовали критерий хи-квадрат Пирсона.Уровень популяционной структурированности оценивали с помощьюанализа молекулярной дисперсии, или AMOVA (Excoffier et al., 1992).
Для оценкигенетической вариабельности использовали F-статистики Райта (Wright, 1949,1965). Генетическая изменчивость была разделена на следующие компоненты:индивидуальная =̅̅̅̅ −внутрипопуляционная =межпопуляционная =;(17)̅ −̅;̅̅ −,(18)(19)где = 1 − ∑ℎ=1 ̅2 .Для оценки изоляции расстоянием вычисляли географические дистанции игенетические расстояния по Неи и Ли (Nei, Lee, 1979) между популяциямикаждого вида.
Для оценки географической подразделенности изучаемыхпопуляций вычисляли поток мигрантов по формуле (Frankham et al., 2002): = [(1) − 1 /4.(20)Также рассчитывали географические дистанции: = √( − )2 + ( + )2 ,(21)где xi и yi ‒ координаты i-ой выборки, xj и yj‒координаты j-ой выборки.Корреляционный анализ матриц попарных значений уровня потока генов (Nm) игеографических дистанций между изучаемыми группами улиток (Dg) проводили с81использованием коэффициента корреляции Мантеля (Mantel, 1967; Diniz-Filhoetal,2013).Для кластеризации популяций применяли невзвешенный парно-групповойметод (UPGMA). Кластерный анализ проводили на основе матрицы генетическихрасстояний по Неи (Nei, 1975), вычисленных по следующей формуле (Hedrick,2000): = − ln ,где =√( )(22),(23)22где = ∑=1 , = ∑=1 , = ∑=1 .Проводили бутстреп-оценку в 1000 генераций.Так как для анализа жизнеспособности исследуемых популяций былииспользованы выборки с ограниченным количеством особей, содержащие лишьнебольшую часть популяционного аллелофонда, нами был проведен анализмультилокусной изменчивости.
Для этого были рассчитаны мультилокусныекомбинации для каждой из исследованных особей.Послечеговкаждойгруппебылооцененообщееколичествомультилокусных генотипов (NMLG) и число уникальных мультилокусныхгенотипов (NMLG-1), или комбинаций, которые были отмечены в однойединственной выборке.Исходя из распределения частот мультилокусных генотипов, для каждойпопуляциибыловычисленопотенциальноегенетическоеразнообразие,ожидаемое при увеличении объема выборки до бесконечности (Nmax). Анализпроводили с помощью двух непараметрических методов: Chao1-bc (biascorrectedformfortheChao1) (Chao, 2005) и метода «складного ножа» первогопорядка (1storderjackknife) (Burnham, Overton, 1978).Расчёт эффективной численности (Ne) изучаемых колоний по формуле,учитывающей уровень инбридинга (F) в популяции (Ли,1978):Ne=N/(F+1).(24)82Ввиду того, что данная формула подразумевает изменение коэффициентаинбридинга от 0 до 1, отрицательные значения коэффициента инбридинга F,полученные в некоторых популяциях, нами принимались равными нулю.
Дляполучения сопоставимых данных мы вычислили отношение эффективногоразмера выборки к её общему объёму (Ne/N).Обработка данных проводилась с использованием программ GenALEx 6.501(Peakall, Smouse,2012), TREECON ver. 1.3b (Vande Peer, 1994), MEGA6 (Tamura,2013). Анализ мультилокусных генотипов проводили в программе SPADE (Chao,Shen, 2009).83ГЛАВА 4. МОРФОМЕТРИЧЕСКАЯ, ДЕМОГРАФИЧЕСКАЯ ИПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА КОЛОНИЙ ЧУЖЕРОДНЫХ ВИДОВНАЗЕМНЫХ МОЛЛЮСКОВ4.1. Морфометрическая структура колоний чужеродных видов наземныхмоллюсковИзвестно, что итогом взаимодействия генетических факторов и факторовокружающей среды является формирование фенотипического облика популяции.У наземных моллюсков это в первую очередь проявляется в характереконхиологических признаков.
Ввиду того, что полиморфных цветовых вариантовраковины, которые могли бы выступить в качестве «фенетических датчиков», уисследуемых видов нам обнаружить не удалось, основное внимание было уделеноразмерным характеристикам раковины, которые позволили оценить адаптивныеособенности популяций видов-вселенцев к условиям вторичного ареала.4.1.1. Морфометрическая структура популяций S. ravergiensisЗначенияморфометрическихпоказателейраковинвисследуемыхпопуляциях кавказской улитки представлены в табл. 4.1.Полученные данные демонстрируют вариабельность метрических значенийраковины в различных биотопах района исследования, о чем свидетельствуетоднофакторный дисперсионный анализ (Kruskal-Wallis test), который показалстатистически значимые различия между группами по всем используемымконхиологическим признакам (табл. 4.2).Попарные сравнения изучаемых групп показывают, что наибольшуювариабельность среди абсолютных параметров раковины имеют высота и ширинараковины, а также высота и ширина устья (таблицы Приложения 19, 20).84Таблица 4.1.Значения конхиометрических параметров S.
ravergiensis (М±m)ПунктДонецМичуринаКалининаБот.садВезелкаКарьерВодстройНовый ОсколНоратусСеванТверьВРШРВУШУ9,6812,656,997,41ВР/ВУ/ШРШУ0,765VSV/S0,944784,8740,9219,12±0,05±0,06 ±0,03 ±0,04 ±0,003 ±0,004±10,07±0,40±0,1711,0814,191130,17 48,90± 23,03±0,08±0,06 ±0,04 ±0,05 ±0,005 ±0,004±14,750,48±0,2110,8114,240,8951123,3349,1924,10±0,09±0,08 ±0,08 ±0,06 ±0,004 ±0,009±19,65±0,74±1,669,6712,430,925756,5538,5619,59±0,05±0,05 ±0,03 ±0,04 ±0,003 ±0,004±9,28±0,38±0,179,7112,600,904782,7040,8719,05±0,06±0,06 ±0,04 ±0,04 ±0,004 ±0,004±11,06±0,43±0,1510,2413,150,974902,8742,4221,13±0,06±0,07 ±0,04 ±0,05 ±0,003 ±0,005±14,34±0,50±0,1910,2213,350,907929,7647,0419,57±0,07±0,07 ±0,04 ±0,05 ±0,004 ±0,005±15,02±0,51±0,180,955929,4438,7124,06±0,07±0,07 ±0,05 ±0,06 ±0,004 ±0,007±15,12±0,56±0,3010,1313,051,008874,9336,0724,18±0,06±0,06 ±0,03 ±0,05 ±0,004 ±0,006±12,01±0,41±0,199,2311,950,975673,3246,1014,48±0,11±0,11 ±0,07 ±0,09 ±0,006 ±0,013±19,41±1,03±0,229,9713,280,955899,4937,4223,84±0,11±0,12 ±0,07 ±0,09 ±0,005 ±0,011±25,79±0,75±0,437,577,436,716,837,217,3410,029 13,47 6,7996,776,296,718,178,317,277,567,428,107,156,746,487,040,7810,7590,7780,7710,7790,7660,7450,7760,7720,7500,928Диаграммы изменчивости конхиологических признаков в исследуемыхгруппах представлены на рисунках (Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
