Диссертация (1154536), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Исследование демографических параметров популяций B. cylindrica иX. derbentina проводилось каждый месяц с мая по сентябрь.Абсолютную плотность (D) особей на участке определяли как среднееарифметическое зарегистрированных в границах каждой пробной площадки (xi)организмов данного вида (Крамаренко, 1995):D=Меруизменчивости∑ показателя.(1)абсолютнойплотности(вариансу,S2)рассчитывали по формуле (Винарский, Крамаренко, 2012):2 =2∑=1(−)−1.(2)Соответственно, статистическую ошибку показателя D рассчитывали как:2 = √ .(3)В случае если распределение особей было отличным от нормального,использовалимедианупоказателяабсолютнойплотности(Винарский,Крамаренко, 2012): = ++1222(4).Статистическую ошибку медианы оценивали как: = 0,287(2 − 1 ),где 1 =−√32+ 1,2 =+√32+ 1.(5)67Параллельно с определением плотности популяций изучали их возрастнуюструктуру.
В соответствии с общепринятым в малакологических исследованияхподходом (Хохуткин, 1997; Винарский, Крамаренко, 2012) все собранные особи S.ravergiensis разделены на три размерно-возрастных класса в зависимости от числаоборотов раковины: I – до 3,5 оборота, II – больше 3,5 оборота, без отворотаустья, III – со сформированным отворотом устья (данный признак указывает нато, что рост раковины прекратился).
Особи B. cylindrica и X. derbentina былиразделены на два возрастных класса: ювенильные и адуальные. Адуальнымисчитались половозрелые особи, со сформированным отворотом устья.Для определения пространственного распределения особей адвентивныхпопуляций использовали метод пробных площадок по схеме, предложеннойКрамаренко с соавт.
(2014). Эксперимент проводили на участке, расположенном вокрестностях мелового карьера в черте г. Белгород (50°62'64″с.ш.; 36°51'77″в.д.).Участок представляет собой открытую местность с прилегающей проселочнойдорогой, преобладает рудеральная растительность. Выбор опытного участкаобусловлен присутствием в данном биотопе всех изучаемых видов, а также тем,что рельеф и растительный покров на данной территории однородны.Необходимо отметить, что один из адвентивных моллюсков, S. ravergiensis,практически не встречается в пределах биотопов, занятых популяциямиB.cylindrica и X.
derbentina.Пробные площадки располагались в виде регулярной сетки: 8 трансект по20 пробных площадок. Расстояние между площадками составляло 1,5 м. Сбормоллюсков осуществлялся в пределах каждой пробной площадки площадью 0,25м2. Особи подразделялись на два размерно-возрастных класса: адуальные иювенильные. Сбор осуществлялся в течение полевого сезона 2017 г., пробыотбирались каждый месяц с мая по сентябрь.Для оценки пространственной структуры популяций изучаемых видовиспользовали индекс Морисита и глобальный индекс Морана (Morisita, 1959;Anselin, 1995; Крамаренко и др., 2014).
Индекс Морисита был выбран в качествеодного из методов ввиду своего широкого применения и возможности68сопоставления полученных результатов с имеющимися в литературе данными.Индекс Морана также довольно часто применяется для оценки пространственногораспределения, кроме того, данный метод позволяет получить результаты,согласующиеся с методами геостатистики (Крамаренко и др., 2014).Индекс Морисита (Morisita, 1959, 1962) рассчитывали по следующейформуле: = ⌈∑=1 ( −1)⌉,(−1)(6)где n ‒ количество пробных площадок, Ni‒ количество особей в i-ой площадке, N‒общее количество особей на всех пробных площадках. Для данного показателябыл рассчитан доверительный интервал (Hairston et al., 1971): = =20,025−+−1,20,975−+−1(7)(8).Далее определяли тип пространственного распределения особей: при Iδ ≤Mu распределение в популяции равномерное; при Mu<Iδ<Mc распределениеслучайное, при Iδ ≥ Mс распределение групповое.Глобальный индекс Морана рассчитывался по формуле (Anselin, 1995;Крамаренко и др., 2014): = [∑=1 ∑=1 ∑=1 ∑=1 ∙( −̅ )∙( −̅ )]∙[2∑=1( −̅ )],(9)где n – число использованных площадок; xi – число особей в пределах i-тойплощадки; xj – число особей в пределах j-той пробной площадки; ̅ – среднеезначение количества особей по всей выборке; wij – дистанция («вес») между i иjпробными площадками в пространстве.Для расчета индекс Морисита использовали стандартный пакет программыR (www.R-project.org, 2016).
Расчет индекса Морана произведен в программеArcGIS 10.2.693.4. Анализ генетической структуры популяций3.4.1. Электрофоретический анализ аллозимовВ качестве материла для экстракции аллозимов использовали мышечные тканимоллюсков. Навески ткани замораживали при ‒80°С, затем после оттаиваниягомогенизировали в 0,05 М Трис-HCl-буфере (pH 6,7). Для разделения белков использовалистандартную методику изотахофореза в полиакриламидном геле (Гааль и др., 1982).Вертикальный электрофорез проводили в камере VE-20 (Helicon, Россия). Былииспользованы гели различной концентрации: для неспецифических эстераз – 10% ПААГ,для супероксиддисмутазы и малатдегидрогеназы – 7,5%.
В качестве гелевого буфераиспользовали Трис-HCl буфер (концентрирующий гель pH 6,7, разделяющий гель pH 8,9),электродного – Трис-глициновый буфер (pH 8,3). Для окрашивания гелевых пластиниспользовали следующие смеси: на выявление неспецифических эстераз – Трис-HCl (pH7,4), α-нафтилацетат, прочный красный TR. Для выявления супероксиддисмутаз ‒ калийфосфатный буфер (pH 7,8), НТС, ФМС. Для выявления малатдегидрогеназ ‒ 0,1 М ТрисHCl (pH 8,4), малат натрия, НТС, ФМС, НАД.У S.
ravergiensis было выделено десять зон активности неспецифических эстераз, изкоторых полиморфными оказались три мономерных локуса: EST6, EST7 и EST8 (с тремяаллелями). Также нами выделен один полиморфный локус димерной супероксиддисмутазыSOD2 с двумя аллелями и димерный локус малатдегидрогеназы MDH2 с тремя аллелями(рис. 3.8 и рис. 3.9) (Снегин, Адамова, 2017).Рис. 3.8.
Локусы аллозимов и соответствующие им генотипы S. ravergiensis(серым цветом отмечены мономорфные локусы)70а)b)c)Рис. 3.9. Фотографии электрофореграмм аллозимов S. ravergiensis: а)неспецифические эстеразы; b) супероксиддисмутаза; c) малатдегидрогеназа.Арабскими цифрами отмечены аллели.ДляанализагенетическойструктурыпопуляцийB.cylindricaиспользовались генетические маркеры известные для данного вида (рис. 3.10 ирис. 3.11) (Крамаренко, Снегин, 2014).71a)b)c)Рис. 3.10. Фотографии электрофореграмм аллозимов B. cylindrica: а)неспецифические эстеразы; b) супероксиддисмутаза; c) малатдегидрогеназа.Арабскими цифрами отмечены аллели.72Рис.
3.11. Локусы аллозимов и соответствующие им генотипы B. cylindricaУ X. derbentina было выделено пять полиморфных локуса неспецифическихэстераз: EST3, EST5, EST8 с тремя аллелями и EST6,EST10 с двумя аллелями.Также нами выделены два полиморфных локуса димерной супероксиддисмутазы:SOD7 и SOD8 с двумя аллелями и димерный локус малатдегидрогеназы MDH2 стремя аллелями (рис. 3.12 и рис. 3.13). Все указанные локусы наследуются покодоминантному типу.Рис. 3.12. Локусы аллозимов и соответствующие им генотипы X.
derbentina73а)b)с)Рис. 3.13. Фотографии электрофореграмм аллозимов X. derbentina: а)неспецифические эстеразы; b) супероксиддисмутаза; c) малатдегидрогеназа.Арабскими цифрами отмечены аллели74Сцельюопределениявектораестественногоотборапроводилисравнительный анализ изоферментов в группах адуальных и ювенильных особейисследуемых видов. Использовались выборки в количестве 40 особей изадвентивных колоний S. ravergiensis, B. cylindrica и X. derbentina, локализованныхв г.
Белгороде, окрестностях мелового карьера. Для сопоставления использоваливыборки из кавказских популяций S. ravergiensis (Севан, Армения) и X. derbentina(Дилижан, Армения). Особей разделяли на две группы (адуальные и ювенильные)в зависимости от количества оборотов и наличия отворота устья. Ювенильнымисчитались особи с 1-2 оборотами раковины; адуальными – особи, закончившиерост раковины. Электрофорез аллозимов проводили по выше описаннойметодике.3.4.2. Анализ генетической структуры популяций методом ПЦР-ISSRГенетическаяизменчивостьвпопуляцияхтакжеоцениваласьсиспользованием полимеразной цепной реакции — метод ISSR (Inter simplesequence repeats) (Zietkiewicz et al., 1994).Материалом для анализа послужили образцы тканей моллюсков (мышцыретрактора, фрагменты мантии).Выделение ДНК осуществляли сорбентным методом (Höss, Pääbo, 1993) снекоторыми модификациями. Образец ткани массой 30-40 мг измельчали,добавляли 200 мкл лизирующего буфера с протеиназой К (0,05 М трис-HClpH 8,0,5 % SDS, 0,02M Na2ЭДТАpH 8,0,2 mMNaCl, 10 мкл раствора протеиназы на 1мл буфера), перемешивали на вортексе и инкубировали в термостате при 37° С втечение 8 часов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
