Диссертация (1154515), страница 9
Текст из файла (страница 9)
coli АТСС 25922 увеличивал своюбиомассу через 24 ч культивирования в 8,78 раз по сравнению с контролем, через48 ч происходило достоверное увеличение связывание красителя в 1,4 раза по54сравнению с показателями первых суток, через 72 ч – в 2,1 раза с последующимснижением к 4-м суткам в 1,28 раз (табл. 5.2.1).E.coli ATCC25922E.coli № 7 (fimH-)E.coli № 92 (fimH+)Рисунок 5.2.1 – Динамика величин связывания кристаллического фиолетового микробнымибиопленками, образованными эталонным и клиническими штаммами E. coliВеличинаинтенсивностипленкообразованияклиническимштаммомE.
coli № 7 на 1-е сутки культивирования характеризовалась увеличениемприроста биомассы в 10,18 раз по сравнению с контролем. Незначительноеувеличение интенсивности связывания красителя наблюдалось на вторые суткикультивирования (в 1,17 раза). На третьи сутки культивирования микробныхбиопленок происходило дальнейшее нарастание биомассы данного штамма иувеличение интенсивности связывания кристаллического фиолетового в 1,81 посравнению с предыдущими сутками, однако на четвертые сутки культивированияпроисходило снижение в 1,34 раза, как и при культивировании эталонногоштамма E.
coli АТСС 25922.Аналогичныерезультатыбылиполученыприкультивированииклинического штамма E. coli № 92, несущего ген fimH. Через 1 сутки55культивированиянаблюдалосьувеличениепоказателясвязываниякристаллического фиолетового по сравнению с контролем в 11,8 раза, через двоесуток происходило дальнейшее увеличение исследуемого показателя в 1,37 разапо сравнению с предыдущими сутками, через 72 ч – в 1,66 раза с последующемснижением прироста биомассы через 96 ч в 1,21 раза.Линейная динамика накопления красителя биопленками как эталонного, таки клинических штаммов E. coli с первых по третьи сутки культивирования,вероятно,связанаспоследовательнымистадиямиеесозреванияидифференцировки, поскольку в этот период микробные клетки характеризуютсяпродукцией неспецифических факторов адгезии и высокой метаболическойактивностью.
Снижение интенсивности связывания красителя через 96 чкультивирования соответствует стадии дисперсии микробных биопленок E. coliввидудефицитапитательныхвеществпристационарномспособекультивировании в условиях in vitro.Согласно полученным результатам, наибольшая интенсивность связываниякрасителя всеми исследуемыми штаммами бактерий отмечалась через 24 чкультивирования. Кроме того, установлено, что для клинического штамма E. coli№ 92, несущего ген fimH, эта способность была достоверно выше по сравнению спленкообразующей способностью эталонного штамма E.
coli АТСС 25922 в 1,34раза и клинического штамма E. coli № 7 в 1,16 раза, у которых данный ген не былобнаружен.Данные о существовании штаммов UPEC, осуществляющих экспрессиюгена fimH, обеспечивающих формирование микробных биопленок, приведены вработах (Bahalo et al., 2013; Reisner et al., 2014; Fattahi et al., 2015). Одними изнаиболее важных факторов вирулентности, способствующих как прикреплению кклеткам организма хозяина, так и формированию бактериальных биопленокявляются фимбрии (типа I и P) (Oliveira et al., 2011).
Образование микробныхбиопленок играет ключевую роль в патогенезе ИМП (Robino et al., 2013).Уропатогенные бактерии E. coli связываются с клетками мочевого пузыря черезадгезин fimH, после чего UPEC встраиваются в структуру клетки посредством56эндоцитоза, что вызывает серию сигнальных эффектов, которые в конечном итогепроводят к интернализации бактерий и образованию биопленки (Eto et al., 2007;Garofalo et al., 2007; Robino et al., 2014).Пленочные формы бактерий зачастую становятся устойчивыми к действиюантибиотиков, к которым они были чувствительны в виде свободно живущихформ.
Одним из возможных объяснений данного явления служит образованиедостаточно инертного метаболического состояния бактерий внутри биопленки,что приводит к уменьшению их чувствительности к антибиотикам, большинствоиз которых лучше действуют на активно делящиеся клетки (Fattahi et al., 2015).Другим возможным объяснением является предположение, что антибиотики,характеризующиеся бактериостатическим действием, только замедляют ростбактерий, а не убивают их, а их уничтожение осуществляется благодаряфагоцитозу. Большие размеры биопленок фактически не позволяют фагоцитамэффективно поглощать данные бактерии (Scott et al., 2015).Такимобразом,входепроведенныхисследованийметодомспектрофотометрии было установлено, что как эталонные, так и клиническиештаммы E. coli способны формировать микробные биопленки в условиях in vitro,однако большая интенсивность пленкообразования характерна для клиническогоштамма E.
coli № 92, несущего ген fimH, который кодирует факторы адгезии –пили I типа.5.3. Исследования морфологических особенностей модели микробнойбиопленки E. coli на поверхности изделий медицинского назначенияПосколькупроцесснеспецифическойадгезиимикроорганизмовиначальные этапы формирования микробных биопленок in vitro происходят впервые сутки культивирования, представляло интерес оценить интенсивностьпленкообразования клинических штаммов E.
coli, отличающихся по наличию генаfimH.Процессформированиямикробныхбиопленокмоделировалинаповерхности изделий медицинского назначения, в качестве которых использовали57уретральный полиуретановый катетер. Небольшие фрагменты катетера помещалив пробирки с мясо-пептонным бульоном, содержащим суточные культурыисследуемых микроорганизмов в концентрации 2×105 мк/мл. После экспозиции втечение 24 ч при 37°С полученные образцы инактивировали в 96%-ом этаноле иготовили препараты для электронно-микроскопического исследования.ОценкаособенностейпленкообразованияклиническимштаммомE. coli № 7, у которого отсутствовал ген fimH, позволила установить, что через 24ч культивирования на поверхности фрагментов уретрального катетера происходилпроцесс адгезии бактерий: отмечались изолированные скопления микробныхклеток, расположенные в один или два слоя, объединенные экзополимернымматриксом, количество которого было незначительным (рис.
5.3.1, А).При формировании биопленки клиническим штаммом E. coli № 92,несущего ген fimH, через сутки культивирования вся поверхность образца былапокрыта многослойной микробной биопленкой, клетки в которой были либонепосредственно связаны между собой, либо их контакт осуществлялся черезкомпоненты экзополимерного матрикса (рис. 5.3.1, Б).
Одни участки биопленкиимели ровную поверхность благодаря микробным клеткам, лишенным матрикса,другие клетки были связаны с экзополимерным матриксом, благодаря чему ихповерхность имела неструктурированный вид. Вся поверхность биопленки былапронизана многочисленными каналами.Активный процесс формирования микробных биопленок на изделияхмедицинского назначения связан с отсутствием специфических защитныхпротивоинфекционных механизмов на инертных поверхностях искусственныхматериалов катетеров, дренажей, протезов и др.
Это и объясняет формированиебактерионосительства при проведении медицинских манипуляций, а такжехронизации инфекционного процесса.582А12БРисунок 5.3.1 - Электронная микрофотография микробной биопленки клинических штаммовE. coli: А-E. coli № 7 (fimH -), Б-E. coli № 92 (fimH +) (1-каналы микробной биопленки, 2структуры экзополимерного матрикса)Даннаяработаиимеющиесялитературныеданныепозволяютпредположить наличие корреляции между экспрессией генов вирулентности ипроцессом образования биопленок, тем самым подчеркивая важность адгезинаfimH для начала и расширения образования биопленок бактерий, вызывающихИМП, и увеличения устойчивости к антибиотикам и дальнейшему развитиюинфекций (Hancock et al., 2010). Также очевидно, что биопленки бактерий более59вирулентны, чем одиночные бактерии, и, таким образом, усиливают ихвирулентность и тяжесть протекания инфекций (Melican et al., 2011).Такимобразом,использованиеметодасканирующейэлектронноймикроскопии позволило установить структурные особенности микробныхбиопленок, образованных клиническими штаммами E.
coli, отличающимися поналичию гена fimH.60ЗАКЛЮЧЕНИЕИнфекции мочевыводящих путей относятся к одним из наиболеераспространенных и часто диагностируемых бактериальных инфекций ипредставляют серьезную проблему для современного здравоохранения (Agarwal etal., 2012). Возбудители ИМП поражают все возрастные группы населения обоихполов, как в условиях стационара, так и во внебольничной среде (Rashid et al.,2015; Salvatore, Resman-Targoff, 2015).В патогенезе ИМП важную роль играют множество видов бактерий, однаконаиболее распространенными возбудителями являются представители семействаEnterobacteriaceae (Gupta et al., 2011). Согласно данным мировой литературы,наиболее частыми возбудителями ИМП являются штаммы E.
coli, на долюкоторых приходится 50-75% всех диагностированных случаев заболеваний, атакжеKlebsiellaspp.,Proteusspp.,Enterobacterspp.,Morganellaspp.,представители других семейств, среди которых с наибольшей частотойвыделяются Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., S. aureus, Enterococcus spp.(Shaaban et al., 2012; Nor et al., 2015).Для лечения ИМП в отсутствие каких-либо осложнений используютантибактериальныепрепараты,такиекакцефалоспорины,пенициллины,аминогликозиды или хинолоны, которые эффективны как при кратковременном,так и долгосрочном применении (Zalamanovici et al., 2010; ECDC, 2014). Степеньчувствительности условно-патогенных микроорганизмов к антибактериальнымпрепаратам различна и зависит от множества факторов, включая место ихлокализации, условия среды и стадию заболевания (ECDC, 2014).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
