Диссертация (1154515), страница 8
Текст из файла (страница 8)
В ходе проведенных намиисследований было установлено, что исследуемые клинические штаммы E. coliпроявляли высокую чувствительность только к амикацину (100% случаев), кдругому представителю III поколения аминогликозидов – тобрамицину –чувствительность была ниже и составила 71%, а к представителю II поколениягентамицину – всего 44%. Поэтому представляло интерес исследовать наличиегенетических детерминант, кодирующих устойчивость к аминогликозидам, сиспользованием ПЦР.В исследованиях использовали 23 клинических штамма E. coli, для которыхбыла установлена устойчивость к тобрамицину и гентамицину. Поскольку однимиз преобладающих механизмов развития устойчивости к аминогликозидамявляетсяихэнзиматическаяинактивацияспомощьюаминогликозидмодифицирующих ферментов, в исследованиях определяли генaac(3)-II, который кодирует фермент ацетилтрансферазу, благодаря которому кантибиотику присоединяется молекула уксусной кислоты, в результате чегопроисходит потеря его активности (Решедько, 1999).47Результатыгенотипическойдетекциигенаустойчивостикаминогликозидным антибиотикам aac(3)-II представлены на рисунке 4.1.3.Рисунок 4.1.3 - Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК клинических штаммов E.
coliна наличие гена aac(3)-IIБыло установлено, что частота встречаемости гена aac(3)-II, размеркоторого составлял 212 ПН, среди исследованных штаммов E. coli превышала78% (рис. 4.1.4). Тетрахорический коэффициент сопряженности составил 0,86(при p < 0,05).20,7 %78,3%21,7%79,3%123Рисунок 4.1.4 - Результаты определения гена устойчивости aac(3)-II у клинических штаммовE. coli (1 - штаммы E. coli, чувствительные к тобрамицину и гентамицину,2 - штаммы E. coli, устойчивые к тобрамицину и гентамицину,3 - штаммы E.
coli, имеющие ген aac(3)-II)48Полученные нами результаты согласуются с данными, приведенными вработахГ.К.РешедькоСидоренко(1999),С.В.о(2002)том,чтоаминогликозидмодифицирующие ферменты способны инактивировать сразунесколько препаратов, поэтому для аминогликозидов характерно наличиеперекрестной резистентности между отдельными препаратами этого класса.Поскольку для фермента, кодируемого геном aac(3)-II, в качестве основныхсубстратов выступают гентамицин и тобрамицин, это и объясняет сочетаннуюустойчивость клинических штаммов E. coli к данным препаратам. Согласноданным, приведенным в работах (Ruppe et al., 2009; Farshad et al., 2010; Saad et al.,2015), аминогликозидмодифицирующие ферменты, кодируемые геном aac(3)-II,нарушаютпроникновениеантибиотиковвбактериальнуюклетку,чтообусловлено уменьшением проницаемости клеточной стенки бактерий дляпрепаратов, нарушением места рибосомного связывания за счет экспрессиимутацийр-РНК-метилаз.способствуютКрометого,широкомасштабноераспространениюиспользованиеустойчивостиаминогликозидоввмедицинской практике, географические различия между генами устойчивости каминогликозидам и активным выведением препарата из клетки за счетэффлюксного насоса.
Каждый из факторов по отдельности и все они всовокупностиприводяткпоявлениюубактерий,вызывающихИМП,устойчивости с действию гентамицина и других аминогликозидов (Giedraitienė etal., 2011; Tada et al., 2013; Schlecht, Bruno, 2015). Высокая эффективностьамикацина в отношении клинических штаммов E. coli может быть объясненаналичием амино-гидроксибутирильной группы в его составе, которая в целомблокирует ферментативные изменения амикацина и не оказывает влияния насвязывание р-РНК с А-центром (Kotra et al., 2000; Dakhl, Alwan, 2015).Таким образом, полученные результаты позволили установить наличие вгеномеклиническихштаммовE.coliдетерминантрезистентностикантимикробным препаратам, находящим широкое применение для лечения ИМП– бета-лактамным и аминогликозидным антибиотикам. Большинство генов,кодирующихлекарственнуюустойчивость,ассоциированосмобильными49генетическими элементами (транспозонами) или локализовано в плазмидах, чтообеспечивает их быстрый горизонтальных перенос и формирование в популяциимикроорганизмов антибиотикорезистентных клонов.4.2.
Определение гена fimHНачальнымэтапомвзаимодействиявозбудителяинфекционногозаболевания с чувствительными клетками макроорганизма является адгезия. Дляуропатогенных кишечных палочек известен широкий спектр факторов адгезии,однако одним из основных являются пили I типа, синтез которых детерминировангеном fimH.
Поэтому представляло интерес изучить наличие данного гена уклинических штаммов E. coli, выделенных от больных Багдадского учебногогоспиталя с признаками ИМП.В исследованиях использовали 111 клинических штаммов уропатогенныхE. coli. С помощью ПЦР было проведено определение наличия гена fimH,кодирующего синтез пилей I типа. Полученные результаты представлены нарисунке 4.2.1.Рисунок 4.2.1 -Результаты ПЦР-анализа образцов ДНК клинических штаммов E. coliна наличие гена fimH50Было установлено, что частота встречаемости гена fimH, размер которогосоставлял 446 пар нуклеотидов, среди UPEC была высокой и составила 63% (рис.4.2.2).fimH+63%fimH37%Рисунок 4.2.2 - Результаты определения гена fimH у клинических штаммов E.
coliДанные результаты согласуется с другими работами (Tarchouna et al., 2013;Abass et al., 2014; Hojati et al., 2015), в которых также отмечено преобладаниеданного фактора адгезии среди прочих факторов вирулентности штаммов UPECприразличнойчастотеобнаружения(68-100%).Тропизмиадгезивнаяспособность уропатогенных E. coli на эпителиальных клетках мочевыделительнойсистемы составляет основу патогенеза ИМП. Установлена принципиальная рольпилейIтипаввнутриэпителиальнуюпроцессеинвазиюадгезиивозбудителя,бактерий,которые,обеспечиваютихинициируядлительнуюперсистенцию, что и приводит к высокой частоте рецидивов ИМП (Маянский,2006).Таким образом, было установлено, что большинство клинических штаммовE.
coli, выделенных от больных с признаками ИМП характеризовались наличиемгена fimH, кодирующего пили I типа, которые обладают высоким сродством крецепторам клетокмочевыделительнойсистемыи необходимыдляраспознавания, присоединения и колонизации уропатогенными бактериями.их51ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ НАЛИЧИЯ ГЕНА FIMH НА АДГЕЗИВНЫЕСВОЙСТВА И ПЛЕНКООБРАЗУЮЩУЮ СПОСОБНОСТЬКЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ E. COLI5.1.
Изучение адгезивной активности штаммов E. coli, отличающихся поналичию гена fimHПоскольку для большинства клинических штаммов E. coli, выделенных отбольных с признаками ИМП, было установлено наличие гена fimH, представлялоинтерес изучить влияние наличия данного гена на адгезивные свойства бактерий.В исследованиях использовали эталонный штамм E.
coli ATCC 25922, а также 20клинических штаммов, выделенных от больных с признаками ИМП иотличающихся по наличию гена fimH.Адгезивные свойства исследуемых бактерий оценивали по среднемупоказателю адгезии (СПА) –среднее число микроорганизмов, прикрепившихся кповерхности одного эритроцита; коэффициенту адгезии (КА) – процентэритроцитов, имеющих на своей поверхности бактерии; индексу адгезиимикроорганизма (ИАМ), который рассчитывали по следующей формуле:ИАМ =СПА× 100%КАВ зависимости от значений ИАМ все исследуемые штаммы бактерий былиразделены на четыре группы. Первую группу составляли микроорганизмы, индексадгезии которых варьировал в диапазоне 1,00 до 1,75; вторая группа включалаштаммы с индексом адгезии от 1,76 до 2,49. В третью группу вошлимикроорганизмы с показателем индекса адгезии от 2,50 до 3,99.
Бактериичетвертой группой характеризовались значением индекса адгезии более 4,00.Оценка адгезивных свойств исследуемых штаммов бактерий позволилаустановить, что по показателям ИАМ эталонный штамм E. coli ATCC 25922характеризовался как низкоадгезивный (табл. 5.1.1). Клинические штаммы E. coliхарактеризовались различным уровнем адгезивной активности, который зависел52от наличия гена fimH. Среди клинических штаммов, лишенных гена fimH, постепени адгезии было выявлено две группы бактерий: штаммы E. coli №№ 7, 17,22 характеризовались как низкоадгезивные, а штаммы E. coli №№ 3, 13, 14, 27, 38,39, 41 –как среднеадгезивные (U-критерий Манна-Уитни = 0; p < 0,05).Таблица 5.1.1 - Значения индекса адгезии микроорганизмов эталонного и клиническихштаммов исследуемых бактерий№Штаммы микроорганизмовЗначения ИАМ1.E.
coli ATCC 259222,1±0,342.E. coli № 3 fimH 2,8±0,17*3.E. coli № 7 fimH 2,2±0,264.E. coli № 13 fimH 2,96±0,85.E. coli № 14 fimH 3,34±0,49*6.E. coli № 17 fimH 1,86±0,067.E. coli № 22 fimH 1,99±0,188.E. coli № 27 fimH 2,72±0,07*9.E. coli № 38 fimH 3,72±0,32*10E. coli № 39 fimH 2,62±0,12*11.E. coli № 41 fimH 3,57±0,46*12.E. coli № 45 fimH +5,04±1,01*13.E. coli № 56 fimH +6,88±0,81*14.E. coli № 59 fimH +7,22±0,54*15.E. coli № 67 fimH +5,84±1,04*16.E. coli № 72 fimH +4,28±0,24*17.E. coli № 79 fimH +6,12±0,32*18.E. coli № 85 fimH +6,02±0,38*19.E.
coli № 87 fimH +5,62±0,32*20E. coli № 92 fimH +7,0±0,93*21.E. coli № 96 fimH +5,82±0,22*Примечание: * - наличие достоверности при p < 0,05 по отношению к контролю.Все исследованные клинические штаммы, имеющие в составе генома генfimH, обладали высокой адгезивной активностью, поскольку значения ИАМсоставляли от 4,28 до 7,22.Факторы адгезии обеспечивают прикрепление микробных клеток наповерхности, чем обусловлены процессы неспецифической адгезии и начальныеэтапыформированиянеспецифическоймикробныхадгезииявляетсябиопленок.обратимым,Посколькутопроцессэффективностьпленкообразования будет зависеть от адгезивной активности микроорганизмови качества поверхности, к которой они прикрепляются.
Адгезия к биологическим53поверхностям, таким как клетки тканей, стенки сосудов, связана с взаимодействиемфимбрий, белков наружной мембраны или лектинового компонента бактерий соспецифическимирецепторами,которыеимеютсянаповерхностицитоплазматической мембраны чувствительных клеток (Афиногенова, Даровская,2011).
Степень адгезии к искусственным материалам зависит от их качества. Так,установлено, что наиболее интенсивно микробные биопленки формируются наизделиях из латекса, силикона, поливинилхлорида, а в меньшей степени – изтефлона, полиуретана, нержавеющей стали и титана (Darouiche, 2001).
Данныематериалы находят широкое применение для изготовления изделий медицинскогоназначения, что повышает риск развития биопленочных инфекций.Таким образом, установлены достоверные отличия адгезивной активностиуропатогенных E. coli в зависимости от наличия гена fimH.5.2. Динамика формирования микробных биопленок эталонным иклиническими штаммами E. coliОбразованиебиопленокявляетсяоднимизважнейшихфактороввирулентности бактерий E. coli, вызывающих ИМП у людей (Anderson et al.,2010).Процесс формирования микробных биопленок моделировали в условиях invitro в лунках иммунологических планшетов в стационарных условиях.Былоустановлено,чтозначения,полученныевовсепериодыкультивирования микробных биопленок условно-патогенных микроорганизмов,достовернопревышаликoнтрольныепоказатели.Путеммножественногосравнения выборок с попарно связанными вариантами установлены достоверныеотличия между штаммами по ранговому дисперсионному анализу Фридмана (χ2 =6,5; p < 0,05).Показано, что эталонный штамм E.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
