Диссертация (1154515), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Для этого из суточной культуры исследуемых бактерий,выращенных на среде Луриа-Бертани (Oxoid Ltd., Великобритания), готовилисуспензию в 1 мл дистиллированной воды, кипятили на водяной бане в течение 10мин и центрифугировали. Надосадочную жидкость использовали как матрицуДНК для ПЦР.2.
Процесс амплификации ДНК осуществляли в объеме 25 мкл, содержащемнижеследующие компоненты (табл. 2.2.2). После смешивания компонентов навихревой мешалке полученную смесь помещали в прибор для ПЦР.Таблица 2.2.2 - Компоненты реакционной смеси№12345РеактивыTaq М мастер-микс (2x)Прямой праймерОбратный праймерМатрица ДНКВода, очищенная от нуклеазОбщий объемОлигонуклеотидныепраймеры,Используемый объем, мкл12,52,52.552,525 мклиспользуемыедляобнаруженияприсутствия генов ctx-m, aac(3)-II и fimH, были предоставлены компаниейIntegratedDNATechnologies(Бельгия)иBioneerCompany(Корея).Характеристика праймеров представлена в таблице 2.2.3.
Раствор готовили всоответствии с методикой производителя путем растворения 10 мкл исходного27раствора праймера в 90 мкл деионизированной дистиллированной воды ссодержанием анионов. Раствор хорошо перемешивалили и хранили при -20°C доиспользования. Концентрация растворасоставляла 10 пмоль/мкл. Передиспользованием раствор перемешивали на вихревой мешалке для гомогенизации.Таблица 2.2.3 - Характеристика ПЦР-праймеров для выявления генов ctx-m, aac(3)-II иfimH уропатогенных кишечных палочекПраймерПоследовательность праймеров (5’– 3’)прямойобратныйпрямойfimHобратныйпрямойaac(3)-IIобратный⃰ Н = Пар нуклеотидов.Пctx-mРазмер продукта(ПН⃰)ЦГЦТТТГЦГАТГТГЦАГАЦЦГЦГАТАТЦГТТГГТЦТГ АТГ ГГЦ ТГГ ТЦГ ГТА ААТТГЦ АЦА ТТЦ ЦЦТ ГЦА ГТЦ АЦАААЦГАТГГГТГАЦГТАТГЦГТЦГААЦАГГТАГЦАЦТГА590446212Реакцию осуществляли в соответствии с работой (Nasehi et al., 2010) втермоциклере для ПЦР. Реакция включала в себя следующие шаги, приведенные втаблице 2.2.4.Таблица 2.2.4 - Этапы амплификации с помощью ПЦР для определения генетическихмаркеровСтадияПерваяIВтораяIIIIIТретья3.ШагНачало денатурацииДенатурацияСпецифическоеренатурированиеУдлинение цепиТемпература95°C94°CВремя5 мин60 сЧисло циклов155°C30 с3072°C60 сОкончание удлинения72°C5 мин1продуктапроводилиОпределениеамплифицированногосиспользованием электрофореза в агарозном геле (Ribeiro et al., 2008).
Для этого 5мкл раствора бромида этидия (0,5 мг/мл) добавляли к 1,5% агарозе, тщательноперемешивали, медленно и аккуратно заливали его на подложку, чтобы избежатьобразования пузырьков воздуха. После застывания геля его аккуратно закреплялив установке для электрофореза (Cleaver Scientific, Тайвань).
В лунки помещали по5 мкл исследуемых и контрольных образцов ДНК. Электрофорез проводили втрис-ацетатном буфере (Promega, США) в течение 50 мин при напряжении 75 В.28Оценку результатов осуществляли с использованием лампы УФ-излучения,полученное изображение фиксировали на цифровую камеру.Адгезивную способность эталонного и клинических штаммов E. coliопределяли с использованием методов В. И. Брилис и соавт.
(1986) и С. С.Гизатулиной и соавт. (1991). В пробирках смешивали по 0,5 мл суспензииэритроцитов человека 0(I) Rh+ группы крови в концентрации 108 кл/мл и взвесьисследуемых бактерий в концентрации 109 мк/мл в физиологическом растворе (рН= 7,2). Смесь инкубировали при температуре 37°С при постоянном встряхиваниина шейкере. После экспозиции в течение 30 мин готовили мазки, фиксировалисмесью Никифорова и окрашивали по методу Грама. Мазки исследовали виммерсионной системе микроскопа.Процесс формирования микробных биопленок моделировали в условиях invitro в лунках иммунологических планшетов согласно стандартной методике (Тец,2006).
Для этого готовили суспензию из суточных культур исследуемых штаммовбактерийвфизиологическомрастворепостандартумутности0,5поМакФарланду. В лунки планшета вносили по 200 мкл мясо-пептонного бульона исуспензии микроорганизмов с концентрацией микробных клеток 105 кое/мл иинкубировали в течение 24 ч при температуре 37°С. После экспозициипланктонные формы эталонного и клинических штаммов бактерий удаляли спомощьюавтоматическойпипетки,лункитроекратнопромывалифизиологическим раствором и вносили на 10 мин 1%-ый водный растворкрасителякристаллическогофиолетового.Лункиаккуратноотмывали,связавшийся с биопленками краситель растворяли в ацетон-этиловой смеси.Количественный учет пленкообразования эталонным и клиническими штаммамиисследуемыхмикропланшетмикроорганизмовEpoch(Биотек,оценивалинаСША)величинепоспектрофотометресвязываниядляимикристаллического фиолетового (ед. ОП). Исследование динамики формированиямикробных биопленок в условиях in vitro проводилась в течение 96 ч.Электронно-микроскопическое исследование микробных биопленок наповерхности изделий медицинского назначения осуществляли с использованием29растрового электронного микроскопа Aspex Explorer.
На поверхность образцовнапыляли токопроводимую пленку золота. Микроскопию проводили приускоряющем напряжении 20 kV, ток эмиссии-50 µА. Изображение получали вовторичных электронах.2.3. Методы статистической обработки экспериментальных данныхСтатистическаяобработкарезультатовпроводиласьспомощьюпрограммного обеспечения Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США),Microsoft Еxcel 2003 (for Windows XP).Определяли χ2, U-критерий Манна-Уитни, тетрахорический коэффициентсопряженности(коэффичиентассоциацииПирсона),использовалимножественное сравнение выборок с попарно связанными вариантами поранговомудисперсионномуанализуФридмана.Объдинениевкластерыпроводили с использованием Эвклидова расстояния и метода полной связи (посреднему группы).
Количество кластеров, которые целесообразно выделять,определяли с помощью графика процесса объединения (Graph of Amalgamationschedule). Выявленному количеству кластеров соответствовало расстояниеобъединения, равное 30. Статистические результаты считались достоверными приp ≤ 0,05.30ГЛАВА 3.
ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ,ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ С ПРИЗНАКАМИ ИНФЕКЦИЙМОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ3.1. Видовой состав микроорганизмов, выделяемых при инфекцияхмочевыводящих путейПосколькуинфекциимочевыводящихпутейсвысокойчастотойвстречаются повсеместно, представляло интерес оценить видовой состав ичастотувстречаемостивозбудителейупациентовБагдадскогоучебногогоспиталя. При исследовании образцов мочи, полученных от 325 пациентов спризнаками инфекций мочевыводящих путей, возбудители ИМП были выделеныиз 200 проб (таблица 3.1.1). В большинстве случаев возбудителями инфекциймочевыводящих путей являлись представители семейства Enterobacteriaceae: в55,5% образцов были обнаружены бактерии E.
coli (χ2 = 675,3; p < 0,05). Klebsiellaspp. выделялась из 14% образцов, Enterobacter spp. – из 11,5%, Proteus spp. – из10%. Достоверно меньшую этиологическую значимость в развитии ИМП имелипредставители аэробных неферментирующих бактерий – Pseudomonas spp. иAcinetobacterbaumannii,которыевыделялисьиз6и1,5%образцовсоответственно.Анализ зарубежных литературных источников показал, что аналогичныерезультаты приведены в работах специалистов из других стран, включаяБразилию (Rodrigues e Barros et al., 2011), Индию (Selvakumar, Jasmine, 2011),Руанду (Muvunyi et al., 2011), Соединенные Штаты Америки (Degnan et al., 2015),Ливию (Abujnah et al., 2015), Пакистан (Ahmed et al., 2015), Иран (Tajbakhsh et al.,2015) и Нигерию (Oshodi et al., 2015). Преобладание штаммов E. coli может бытьсвязано с тем, что уропатогенные кишечные палочки (UPEC), выделяясь из мочипациентов с ИМП в 80-90% случаев, характеризуются набором специфическихфакторов вирулентности, включая адгезины (фимбрии и пили типов I, P, S/F1C иафимбриальные факторы адгезии Dr и Afa), токсины, сидерофоры, жгутики и31полисахаридные компоненты клеточной стенки (Далин, Фиш, 1985; Mladin et al.,2009; Reza et al., 2011; Tchesnokova et al., 2011; Hernandez, 2013).
Данные факторывирулентностиобеспечиваютадгезиюбактерийкклеткамуроэпителия,способствуют их выживанию вне кишечника, удержанию во влагалище, подъемувверх по мочевыводящим путям (инфицированию), изменяют гидрофобныеповерхностные свойства клеток и вызывают цитопатические эффекты (Schwartz etal., 2013; Greene et al., 2015).Таблица 3.1.1 – Видовой состав микроорганизмов, выделенных от больных с признакамиинфекций мочевыводящих путейВозбудителиEscherichia coliKlebsiella oxytocaKlebsiella pneumoniaeEnterobacter aerogenesEnterobacter cloacaeProteus mirabilisProteus vulgarisPseudomonas aeruginosaMorganella morganiiAcinetobacter baumanniiИтогоКоличество штаммовабс.%11155,5201084157,58410510512631,531,5200100Клинический материал, из которого были выделены возбудители, былполучен от пациентов разных возрастов, которые были разделены на 7 групп (рис.3.1.1).Было установлено, что наибольшая частота случаев ИМП регистрироваласьу людей возрастной группы 27-36 лет, на втором месте были пациенты в возрасте37-46 лет, на третьем месте - лица в возрасте 17-26 лет.
Наименьшая частота ИМПнаблюдалось у пожилых пациентов в возрасте от 57 до 76 лет.323% 2,5%16%13,5%16,5%21%27,5%6 - 16 лет47 - 56 лет17 - 26 лет57 - 66 лет27 - 36 лет67 - 76 лет37 - 46 летРисунок 3.1.1 - Выявление возбудителей ИМП в разных возрастных группахУ детей в большинстве случаев развитие ИМП связано с пузырномочеточниковым рефлюксом, благодаря которому моча возвращается обратно впочки из-за нарушения клапаноподобного механизма в месте впадениямочеточников в мочевой пузырь, а также с неполным опорожнением мочевогопузыря, низким уровнем личной гигиены, использованием подгузников,задержкой мочеиспускания и нарушением питания (Harmsen et al., 2007; Shulmanet al., 2007; Neal, 2008; Ghanesherbaf et al., 2011; Hashemiparast et al., 2015).У лиц в возрасте старше 50 лет частота встречаемости ИМП наблюдаласьвыше у мужчин, что, вероятно, связано с развитием заболеваний предстательнойжелезы, таких как простатит и гиперплазия (NICE, 2015).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
