Диссертация (1154485), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Для меланиновхарактерны группы, содержащие подвижный протон: -СООН; -ОН; -SO3H инейтральные электронодонорные группы: R2CO; R3PO; R3N, участвующие вобразовании комплексов меланина с ионами тяжелых металлов, что значительноснижаетихдоступностьфизиологическуюдляактивность,организмов.котораяМеланиныпроявляетсяимеютввысокуюантитоксичных,антиоксидантных, фотопротекторных, генопротекторных качествах, а также вфитостимулирующих свойствах (Ровбель и др., 2000; Бакулин и др., 2009; Тонояни др., 2010; Гесслер, Егорова, Белозерская, 2014; Курченко, 2015).Мыпредположили,чтоэкотол,образующийсяприаэробнойбиотехнологической конверсии соломы в результате деятельности грибов ибактерий, содержит меланины, тем более, что для экотола характерно коричневоеокрашивание разной степени интенсивности от светло-желто-коричневого дочерно-коричневого в зависимости от источника растительного сырья, из которогоего получают (Лебедев, 2004, с.
116), и сроков хранения экотола. Такоеокрашивание характерно для группы высокомолекулярных нерастворимых илималорастворимыхферментативногомеланиновыхокисления,пигментов,аутоокисленияобразующихсяивполиконденсациирезультатепростыхфенольных предшественников (Курченко, 2015). Кроме того, как было намиустановлено, большая часть биогенных аминов в экотоле приходится на долюдофамина и его предшественника ДОФА, которые представляют собойфрагменты меланиновых пигментов.При установлении в экотоле наличия меланинов было осуществлено ихвыделение и идентификация (см. Параграф 2.4., с. 61) из лиофильно высушенных90образцов, где помимо экотола, полученного в нашей работе, мы использовалиэкотол семилетнего хранения из коллекции Н.Г. Лебедевой (табл.
3.2).Таблица 3.2. Содержание меланинов в экотолах, отличающихся срокамихранения и источниками биомассыНомеробразцаИсточник биомассыОкрашиваниеэкотолаВыходмеланина, %1Солома Triticum L. – пшеницы*Коричневое2Надземная часть Chelidonium L. – Желто-коричневоечистотела**1,53Надземная часть Avena sativa L. Желто-коричневоеовса**1,74Солома Triticum L. пшеницы**3,22,5Темно-коричневое*Экотол, полученный в год анализа.**Экотол, хранившийся в течение 7 лет, из коллекции Н.Г. Лебедевой.Из таблицы следует, что во всех проанализированных образцах экотола,полученного из различного растительного сырья, были обнаружены меланины.Приидентификациианализируемогоматериалаосновноевниманиеобращалось на его парамагнитные свойства, которые представляют собойспецифическую особенность меланинов, как природных полимеров, содержащихразвитые системы сопряженных связей. Наличие неспаренных электронов ввысокомолекулярных природных соединениях оказывает существенное влияниена многие их свойства – растворимость, электропроводность, обменную емкость,химическую реакционоспособность и биологическую активность.
Близкиезначения g-факторов 2,0042 ± 0,0003 позволяют предположить единую природупарамагнитных центров для всех исследованных меланинов, независимо отисточника их выделения. В очищенных препаратах наших образцов содержание91парамагнитных центров составляло от 2,6×1016 спин/г до 8,9×1016 спин/г.
Этиданные согласуются с результатами, приведенными в сообщениях других авторовдля грибных, животных, растительных и синтетических меланинов (Курченко,2015). Следует отметить, что полученные значения содержания ПМЦ длямеланинов ближе к нижнему пределу величин, описанных в литературе.
Этоможет объясняться тем, что при выделении меланинов в условиях длительноговоздействия высоких температур (которые в нашем случае не использовались)происходит увеличение концентраций ПМЦ в 5-7 раз. Кроме сигналов,описанных выше, при температуре жидкого азота в наших образцах былизарегистрированы дополнительные сигналы с шириной линии 30 – 65 Гс и gфактором значительно превышающим g-фактор свободного электрона (от 2,998до 3,004).
Такие сигналы были обнаружены в спектрах практически всехмеланинов (Курченко, 2015).Меланины при биотехнологической конверсии растительного сырья моглипоступать в культуральную среду из находящихся в ней меланизированных грибов.В культуральной среде всегда обнаруживаются меланизированные грибы родаAlternaria, а также меланизированные целлюлозоразрушающие грибы родовAspergillus, Cladosporium и др. Кроме того, в культуральной среде былиобнаружены микроорганизмы из рода Bacillus, некоторые штаммы которых такжемогут являться продуцентами меланиновых пигментов (Лебедев, 2004; Тоноян идр., 2010; Гесслер, Егорова, Белозерская, 2014).На основе проведенного анализа элементного состава и парамагнитныхсвойств (см.
Параграф 2.4., с. 61) меланины, содержащиеся в образцах экотола,наиболее вероятно отнести к эумеланинам – азотосодержащим гетерополимерам (внаших образцах содержание азота колеблется от 0,76 % до 2,23 %), биополимераминдолил-5,6-хинона с включением пиррольных и ДОФА-хиноновых фрагментов.Поскольку в результате семилетнего хранения экотола, полученного наоснове соломы пшеницы, усиливалась его цветность и несколько увеличивался92выход меланина, мы предположили в процессе хранения экотола возможностьизменения соотношения ароматических и алифатических фрагментов.3.3.Ароматические и алифатические фрагменты экотола после егодлительного храненияАроматические и алифатические структурные фрагменты в исходномэкотоле из соломы пшеницы были изучены с помощью метода пиролитическоймасс-спектрометрии33,которыйвыявил,чтоалифатическиесоединениясоставляют 93,3 %, а на долю ароматических соединений приходится ~ 6,5 %.
Насинтересовало, будет ли изменяться соотношение алифатических и ароматическихфрагментов экотола после его длительного хранения – 7 лет при температуре 6-8ºС. Для анализа содержания структурных фрагментов алифатических иароматических соединений был использован метод ЯМР-спектроскопии высокогоразрешения (см. Параграф 2.3., с.
60). Перед проведением анализа экотоласемилетнего хранения надосадочная жидкость и осадок разделялись и лиофильновысушивались. Спектроскопическому ЯМР анализу были подвергнуты дваобразца. Образец № 1 имел соотношение надосадочной жидкости к осадку,равное 3:1, образец № 2 − соотношение 1:3. После контакта с дейтерированнойводой,ультразвуковойобработки,отстаиваниемвтечениесутокицентрифугированием образец № 1 имел светло-желтую окраску, а образец № 2 –коричневую.Количественное содержание ароматических и алифатических фрагментов вэкотоле представлено в таблице 3.3.Работа проводилась в лаб.
кафедры физической и коллоидной химии РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева (Лебедев, 1999).3393Таблица 3.3. Содержание атомов водорода различных фрагментов в экотоледлительного хранения, полученные в условиях регистрации спектра ЯМР 1НОбразцы№Содержание фрагментов в %образцаСоотношениенадосадочнойжидкости к осадкуЦветность,дисперсность№13:1№21:3СНарСНалк-ОСНалкСветло-желтый,мелкодисперсный134344Коричневый,крупнодисперсный154936Из результатов, представленных в таблице 3.3 следует, что содержаниеароматических протонов в образцах с разным соотношением надосадочнойжидкости к осадку мало различается и составляет 13-15 %, содержание СНалк-О:43-49 %.
Значение СНалк (протоны алифатических фрагментов, соединенных сатомами C/N) варьируется более значимо – 44 % в образце № 1 и 36 % в образце№ 2. Было обращено внимание на то, что во всех спектрах проявляется несколькоузких сигналов, наибольший из них имеет химические сдвиги около 1.8 и 3.2 м.д.(миллионных долей или ppm). По всей видимости, они относятся к обнаруженнымнами меланинам. Поскольку содержание алифатических и ароматическихфрагментов исходного экотола, проанализированного ранее с помощью методапиролитической масс-спектрометрии (Лебедев, 1999, с. 67, 68), и экотола,хранившегосявтечение7лет,проанализированногометодомЯМР-спектроскопии, представлены в процентах, мы посчитали возможным провести ихсопоставление.
Оно показало, что при длительном хранении экотола имеет местонезначительное уменьшение процентного содержания алифатических фрагментовв среднем на 7 % (сумма СНалк-О и СНалк, длительно хранившегося экотола,составляет примерно 86 %; в исходном экотоле, как было отмечено ранее – 93 %).94Количество ароматических соединений, представленных в экотоле, хранившемся7 лет, составляет в среднем 14 %, а в исходном – 6,5 %, т.е. в течение 7-летнегохранения экотола ароматических соединений становится ~ на 7 % больше. Это немного и свидетельствует о том, что в хранившемся экотоле имеет место слабоеразвитиеавтоконденсационныхпроцессов.Изменениевсоотношенииалифатических и ароматических структурных фрагментов имеет место не толькоза счет образующегося осадка в результате длительного хранения экотола,поскольку разница в анализируемых образцах № 1 и № 2 по алифатическим иароматическим структурным фрагментам менее значима по сравнению спреобладанием в образце № 2 осадочного материала.
При этом надо учитывать,что компоненты обоих образцов были лиофильно высушенными и не отличалисьв весовом отношении.То, что сравнение спектров ЯМРН экотола, полученных нами, со1спектрами гуминовых веществ, выделенных из почвы, угля, торфа или лигнинов,полученными в работе Н.Г. Неизвестной (Неизвестная, 2013), демонстрирует ихсущественноеотличие,вполнезакономерно.Пониженноесодержаниеароматических протонов в экотоле объясняется тем, что получение экотоласвязано в основном с трансформацией органических остатков. В таком состоянииэкотол может находиться длительное время (годы) до тех пор, пока он не попадетвпочву.Впочвеприналичиисоответствующихмикроорганизмовосуществляется процесс гумификации (Комаров, 2004; Комаров1, Комаров2, 2015).Предпосылки для образования гуминовых соединений в почвенной среде наоснове экотола имеются, о чем можно судить по сходству ИК-спектров в области1230-3500 см-1, отражающих сходство в составе групп атомов, входящих вароматические и алифатические структурные фрагменты гуминовой кислотыпочвы и экотола (см.
рис. 1, Приложение 1, с. 154).95…Подытоживаяматериал,изложенныйвпредыдущихпараграфах,подчеркнем, что мико- и микробиота, участвующая в деградации растительногоматериала, привносит в среду, в нашем случае – экотол, целый рядфизиологически-активныхсоединений,обуславливающихегополифункциональные свойства, которые способны оказать воздействие нарастения (см. Параграф 3.4.).3.4.Влияние экотола на рост древесных саженцев Acer platanoides L.в природных условияхДля выяснения воздействия экотола на двухлетние древесные саженцы Acerplatanoides L.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
