Диссертация (1154485), страница 14
Текст из файла (страница 14)
На кафедре биофизики МГУ им. М.В. Ломоносова быласконструирована специальная «камера-зажим», позволяющая проводить такиеизмерения, и разработана методика измерений. В разработанной конструкцииосновные элементы включают светодиоды для импульсного возбужденияфлуоресценции и фотодиод для регистрации флуоресценции. Малые габаритыприбора позволяют использовать флуорометр для полевых измерений наинтактных растениях.О характере эффективности использования света в реакциях фотосистемы IIсудят по отношению Fv/Fm, т.е.
переменной (вариабельной) флуоресценции (Fv =Fm – Fo) к максимальной Fm. Переменную флуоресценцию хлорофилла измеряют спомощьюимпульсно-модулированногофлуорометра.Темновойуровеньфлуоресценции хлорофилла при открытых реакционных центрах Fo определяютпосле выдерживания побегов в темноте в течение 3-5 минут, используяимпульсный измеряющий свет от красного светодиода (длина волны 680 нм). Придополнительном кратковременном освещении интенсивным постоянным светом,которое вызывает переход реакционных центров фотосистемы в закрытоесостояние, регистрируется максимальный выход флуоресценции Fm.
Весь процессизмерения происходит под управлением компьютера и занимает не более 2-4минут. Для измерения флуоресценции хлорофилла в коре, побег фиксируется вспециальном зажиме, в котором закреплен световод с тремя отводками дляподсоединения источников измеряющего и действующего света, а такжефотодиода, регистрирующего флуоресценцию.Измерения проводили под верхушечной почкой с адаксиальной (от лат.
ad к и лат. axis ось) стороны побега саженцев ясеня. Измерения проводили неменее чем на 6 побегах.77Данный метод оказался неприемлем для саженцев рябины, что былообнаружено сразу при отработке методики (рис. 2.6), т.к. под верхушечнойпочкой у рябины имеются чешуйки, из-за чего хлоропласты располагаются наразличном расстоянии от пробкового слоя коры, прозрачность котороговарьирует, внося значительные погрешности в измерения.Рис. 2.6. Процесс измерения флуоресценции хлорофилла в коре побегов рябины спомощью «камеры-зажима»2.10.2.Определение активности пероксидазыПероксидаза – фермент класса оксидоредуктаз (КФ 1.11.1.7), представляетсобой гемопротеид.Активность пероксидазы определяли методом, основанном на измерениискоростиреакцииокислениябензидинаподдействиемпероксидазы,содержащейся в растительной ткани.
Для этого измеряли время образованияопределенной концентрации продукта окисления бензидина, имеющего синююокраску. Работа осуществлялась согласно методике, описанной в Большомпрактикуме по физиологии растений (Гавриленко, Ладыгина, Хандобина, 1975).78Для определения активности пероксидазы навеску листьев 100 мг растиралив фарфоровой ступке с ацетатным буфером, рН 5,4, до полной гомогенизации.Гомогенат переносили в мерную колбу на 25 мл и доводили до метки.Растительную вытяжку настаивали в течение 10 мин, а затем центрифугировалитакже в течение 10 мин при 3000 об./мин. Полученную надосадочную жидкостьиспользовали для определения активности пероксидазы.Измерение активности фермента проводили в той же последовательности,что и приготовление вытяжек.Раствор бензидина нам был любезно предоставлен с.н.с. Е.В.
Юриной(Комплексная лаборатория «Чашниково» Биологического факультета МГУ им.М.В. Ломоносова).Перекись водорода 0,03% готовилась из аптечной перекиси.Определение пероксидазы проводили на ФЭКе (фотоэлектроколориметре).В две кюветы толщиной 2 см наливали по 2 мл вытяжки, 2 мл буферногораствора, 2 мл раствора бензидина. Кюветы помещали в кюветодержателиприбора: слева (контроль), справа (опыт). С помощью оптических клиньевсначала при чувствительности «1», затем «2» уравнивали оба световых потока.При этом стрелка гальванометра устанавливалась в нулевом положении.
Правыйотсчетный барабан ставили на деление 0,250 (по шкале оптической плотности),что сопровождалось перемещением стрелки гальванометра в сторону. В левуюконтрольную кювету наливали 2 мл воды, в правую опытную кювету пипеткой сшироким носиком 2 мл 0,03 % - ной Н2О2. Сильная струя перекиси перемешиваласодержимое кюветы. С первой капли перекиси включали секундамер. В кювете сперекисьюрастворсинел,чтосопровождалосьпередвижениемстрелкигальванометра к нулевому положению.
По секундамеру отмечали время от началаприливания Н2О2 до достижения стрелкой гальванометра нулевого положения, т.е.измеряли время компенсации плотности синего окрашивания раствора погальванометру, что зависело от активности фермента.79Результаты выражали в условных единицах (А) и рассчитывали по формуле:А = (D(α·γ))/(td),(2.2)где D – оптическая плотность, равная 0,250; d – толщина слоя жидкости в см(толщина кюветы), в нашем случае 2 см; t – время в секундах; α, γ – факторыразведения; α – отношение количества жидкости, взятой для приготовлениявытяжки в мл к весу навески в г; γ – степень постоянного разведения вытяжки вреакционной смеси; (дополнительного разведения вытяжки не требовалось).Результаты выражались в условных единицах на 1 г сырой биомассы.Измерения проводили трижды и брали среднее значение.2.10.3.Метод определения белкаМетод определения белка основан на измерении окраски, возникающей приодновременном протекании биуретовой реакции и реакции фолина.
Белок сначалаобрабатывали щелочным раствором Cu (количество щелочи должно бытьдостаточным, чтобы нейтрализовать кислоту, содержащуюся в реактиве фолина).После обработки белка щелочным раствором Cu добавляли реактив фолина(Lowry et al., 1951).При определении содержания белка использовали навеску листьев массой300 мг. Пробу брали у второго и третьего листа верхнего побега.
Навескурастирали в 4 мл трис-буфера рН 8,5. Осажденный белок центрифугировали втечение 10 минут при 2000 об./мин. В полученный супернатант (жидкость послецентрифугирования) добавляли реактив фолина.Замеры проводили фотоколориметрическим методом на ФЭК-М с краснымсветофильтром через 30 минут после добавления реактива фолина.Калибровочную кривую строили, используя раствор альбумина.802.11. Определение содержания свинца в корнях и хвое Picea abies L. методоммасс-спектрометрииМасс-спектрометрия – метод качественного и количественного анализа,основанный на разделении ионов анализируемого вещества по отношению ихатомной массы к заряду и определении их количества в анализируемой пробе(Inductively coupled plasma mass spectrometry handbook, 2005).Анализ содержания свинца в корнях и хвое ели проводили на массспектрометре 7500a ICP-MS фирмы Agilent Technologies (США) согласнотребованиям методики ПНД Ф 16.2.2:2.3.71-2011 «Количественный химическийанализ почв.
Методика измерений массовых долей металлов в осадках сточныхвод, донных отложениях, образцах растительного происхождения спектральнымиметодами» (ПНД Ф 16.2.2:2.3.71-2011).Анализ растительного материала по количественному содержанию свинца вкорнях и хвое саженцев ели был произведен одновременно с отбором почвенныхобразцов для определения валового содержания и подвижных форм свинца впочве, на которой выращивались растения (см. Параграф 2.7., с. 66). При этомкорни отбирали с глубины 7-8 см по кружности радиусом от ствола 6-8 см дообщей массы навески 10 г для каждого из вариантов.
После чего корни тщательнои осторожно промывали проточной, а затем дистиллированной водой, ивысушивали при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния. Послевысушивания корни измельчали.Параллельно с подготовкой к анализу корней проводился отбор проб хвои спобегов третьего и второго порядков, расположенных с разных сторон от стеблярастения до общей массы навески собранной хвои 10 г для каждого из вариантов.После отбора хвою промывали проточной, а затем дистиллированной водой,чтобы удалить осевшие на ней загрязнения. Перед проведением анализа81отобранную хвою высушили при комнатной температуре до воздушно-сухогосостояния и измельчили.Подготовка для анализа высушенных и измельченных корней и хвоипроводилась по той же методике, что и при определении валового содержаниясвинца в почве (см. Параграф 2.7.1., с.
66). Масса навески одной повторностикаждого измерения составляла 0,5 г. Повторность измерений – пятикратная.По результатам анализа стандартных растворов строили калибровочныеграфики для свинца. По ним находили концентрацию свинца в анализируемыхпробах.2.12. Определение плотности корневых окончаний и количественныххарактеристик микориз, находящихся в симбиозе с Picea abies L.Для сравнительной характеристики корневой системы исследуемыхвариантов ели обыкновенной нами были определены плотность корневыхокончаний,плотностьмикориз(плотностьмикоризныхокончаний)иинтенсивность микоризации.В конце вегетационного периода корневые системы саженцев ели былиполностью изъяты из вегетационных сосудов, промыты проточной водой изаспиртованы для последующего анализа.При определении параметров корневых окончаний и количественныххарактеристик микориз мы исходили из предложенных Д.С.
Веселкинымпредставлений, касающихся микориз, микоризных окончаний и корневыхокончаний.Так микоризу мы рассматривали, как структурное образование простой(неразветвленной) или сложной (разветвленной) формы, развившееся из одногокороткого сосущего корня, то есть прикрепляющееся к проводящему корню водном месте и покрытое общим микоризным чехлом одинаковой структуры на82всем протяжении; микоризное окончание, как любое терминальное корневоеокончание, имеющее эктомикоризный чехол; корневое окончание, как любоетерминальное ответвление корневой системы, независимо от того имеет этоокончание микоризный чехол или нет.
Таким образом, выражение суммакорневых окончаний включает сумму микоризных окончаний и немикоризныхкоротких корней (Веселкин, 1999, с. 20).Определение плотности корневых окончаний и плотности микориз(микоризных окончаний) проводилось в соответствии с методикой И.А.Селиванова (Селиванов, 1981, с. 19). Для этого у каждого варианта саженцев елиотбирали 50 см проводящих корней последнего и предпоследнего порядков ипроизводили подсчет определяемых структур, приходящихся на данную длинукорня. Далее полученные результаты относили к 10 см длины корня.Интенсивностьмикоризациирассчитывали,какотношениечисламикоризных окончаний к общему числу зарегистрированных корневых окончаний(Веселкин, 1999, с.
20).Подсчет корневых окончаний, в том числе микоризованных, вели подмикроскопом ЛОМО МИКМЕД-1 при увеличении 100 х.Увзятыхнамивкачествеобъектаисследованиясаженцевелиобыкновенной эктомикоризы представляли собой довольно плотный чехол,состоящий из сплетений отдельных грибных нитей (гиф). Сплетения грибных гифнапоминали войлок с не ярко выраженной белой окраской, в связи с чем,микоризованные корневые окончания были трудно отличимы от корневыхокончаний, не содержащих микориз (рис. 2.1. Б, с. 57).Для лучшей идентификации микоризных окончаний, отобранные корниокрашивали.
После окрашивания корневых систем согласно разработаннымметодикам грибные гифы приобретают контрастную окраску в отличие от самихкорней и корневых волосков, которые не изменяют окраску или окрашиваютсяслабо (рис. 2.8). В нашей работе мы придерживались методики окрашивания,83предложенной Селивановым И.А. и Брундреттом М. (Селиванов, 1981, с.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
