Диссертация (1154485), страница 11
Текст из файла (страница 11)
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ2.1. Объекты исследованияОбъектами исследования являлись класс природных физиологическиактивных соединений – экотол, получаемый в результате биотехнологическойконверсии бывшего живого вещества – соломы, и саженцы древесных растений,используемые для восстановления и создания устойчивых лесопарковыхнасаждений и озеленения санитарно-защитных зон в Европейской части России.2.1.1. Саженцы древесных растенийДля полевого опыта по выяснению воздействия экотола на растения вприродных условиях были выбраны двухлетние саженцы Acer platanoides L.(клена остролистного), быстро вырастающие в крупные деревья. Саженцы быливыращены нами из семян на территории, принадлежащей учебно-опытномупочвенно-экологическому центру МГУ им.
М.В. Ломоносова «Чашниково» (УОПЭЦ МГУ Чашниково). Семена клена остролистного осенью 2006 г. быливысеяны на делянку в мелкие бороздки, расположенные на расстоянии 70 см другот друга, по 10 шт. в каждую бороздку. Почва, на которую высевались семена,согласно данным почвенно-экологического центра, представляет собой дерновоподзол с низким содержанием органического вещества (Сорг. – 1,5 %) и, согласнонашим определениям, содержит валового свинца в 5 раз ниже ПДК 6,5 мг/кг.Для вегетационных опытов по оценке воздействия экотола на древесныесаженцы в условиях нормы и избыточных концентраций свинца в почве быливзяты трехлетние растения Fraxinus pensylvanica (ясень пенсильванский), какнаиболее устойчивый к антропогенным воздействиям вид, Sorbus aucuparia L.(рябинаобыкновенная),котораяявляетсясреднеустойчивымвидом,57рекомендуемым при групповых посадках для озеленения городов, и Picea abies L.(ель обыкновенная), как вид, восприимчивый к загрязняющим веществам.
Ельобыкновеннаявоптимальныхусловияхдляростаявляетсяпородойбыстрорастущей, для нее характерна значительная пластичность. Ель быстроизменяет свои свойства под воздействием среды, ее рост и физиологическоесостояние зависят от качества почвы, ее механического состава, влажности изагрязненности тяжелыми металлами (Кулагин, 1974; Сенновская, 2006).Подробнее о древесных растениях см. книгу Дмитрия Кайгородова «Беседы орусском лесе» (Кайгородов, 2010).Саженцыясеняпенсильванскогоирябиныобыкновеннойбылипредоставлены Пушкинским питомником, саженцы ели обыкновенной –питомником УО ПЭЦ МГУ Чашниково.
При отборе саженцев ели насинтересовало наличие микоризы на корневых окончаниях растений (рис. 2.1. А,Б).А. Подбор саженцев ели с учетомналичия на корневых окончаниях микоризыБ. Микоризованные окончания корней ели(обозначены красными стрелками)Рис. 2.1. Отбор саженцев ели с учетом наличия на корневых окончанияхмикоризы2.1.2. ЭкотолРасширяяпредставлениеобэкотоле,егобиохимическомсоставе,анализируя функциональное воздействие экотола на ростовые процессы растений,на подвижность тяжелого металла – свинца, находящегося в разной степени58связанности и поступающего в растения, мы, тем самым, рассматривали экотол,такжекакдревесныесаженцы,спозицииобъектаисследования,новыполняющего в биосфере совсем иную полифункциональную роль, чем живоевещество или косное вещество. Об имеющихся в настоящее время сведениях обэкотоле см.
Параграф 1.3.2., с. 39.2.2. Получение экотола в лабораторных условияхВ лабораторных условиях экотол синтезировался нами в бутыли емкостью ~20 л. В качестве исходного растительного материала в данной работеиспользовалась солома пшеницы сорта Хакасская, которая предварительноизмельчалась. Далее бутыль, с помещенной в нее соломой, заполняли отстояннойв течение нескольких часов водой на 2/3 объема.
Для того чтобы получениеэкотола проходило в аэробных условиях, на дно бутыли был помещенраспылитель воздуха, с помощью шланга подсоединенный к компрессору. Внашей работе использовался воздушный компрессор, предназначенный дляаквариума. Подготовленная к эксперименту бутыль (рис. 2.2) была помещена вбольшой таз, так как в процессе разложения бывшего живого вещества имеетместообразованиепены.Процессполученияэкотоласопровождаетсянеприятным запахом.Получение экотола проводилось при температуре + 20 °С ± 5 °С.Содержимое бутыли периодически встряхивалось. Окончание пенообразования ивыделения СО2, а также отсутствие запаха, свидетельствовало о завершениипроцесса, который проходит примерно за 3 месяца. Полученный препарат былпрофильтрован через несколько слоев марли, после чего использовался вэкспериментах.Показатель рН экотола, синтезированного нами, был близок к нейтральному~ 7,5, что согласуется с данными Г.В.
Лебедева (Лебедев, 1999, с. 30).59Рис. 2.2. Установка для получения экотола в лабораторных условияхСостояние экотола в течение многолетнего хранения 5-7 лет притемпературе ~ 6-8 °С, несмотря на образование некоторого количества осадка, восновном оставалось стабильным, о чем мы судили по незначительнымизменениям в суммарном составе ароматических и алифатических структурныхфрагментов, сопоставляя эти данные с аналогичными, полученными при анализеисходного экотола после завершения процесса биотехнологической конверсииразмельченного растительного сырья (см. Параграф 3.3., с.
92), а такжесохранению в течение 5 лет в экотоле биогенных аминов, их предшественников ипродуктов окислительного дезаминирования (см. Параграф 3.1., с. 85).602.3.Определение биогенных аминов, их предшественников и продуктовокислительного дезаминирования в экотолеСодержание биогенных аминов, их предшественников и продуктовокислительногодезаминированиявэкотолеопределялиметодомвысокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с электродетекцией нахроматографе LC-304T (BAS, West Lafayette, США) с инжектором Rheodyne 7125.Высокоэффективная жидкостная хроматография – микроаналитический метод,позволяющий работать с очень малыми дозами вещества (в пределах наномоль/л).В эксперименте использовали лиофильно высушенный экотол, 100 мг которогорастворяли в 1 мл H2O.
Метод хроматографии заключается в разделении смеси нахроматографической колонке на отдельные компоненты, после которого припомощи детекторов проводят их идентификацию (Бауэр и др., 1988, с. 8, 10).Изучаемые вещества разделяли на термостатируемой при 25 °С обращенофазовой колонке ReproSil-Pur, ОDS-3, 4×100 мм, размер частиц 3 мкм («Dr.MajschGMBH», «Элсико», Москва). Скорость элюции подвижной фазы – 1,0 мл/мин,давление 2,0 атм. Мобильная фаза содержала 0,1 М цитратно-фосфатный буфер с1,1 мМ октансульфоновой кислоты, 0,1 мМ ЭДТА и 9 % ацетонитрила (рН 3,0).Сочетание высокоэффективной жидкостной хроматографии с количественнойдетекциейобнаруженияопределяемыхвеществ,находящихсявнизкихконцентрациях (наноМ/л) при слабой чувствительности к примесям основныхвеществ сложной смеси, которую представляет собой экотол, собственно ипозволило провести измерения биогенных аминов, их предшественников ипродуктов окисления.
Сами измерения проводили на стеклоугольном электроде(+ 0,85V) против Ag/Ag Cl электрода. Фиксируемая прибором интенсивностьизмеряемого электрического тока, возникающего при контакте анализируемоговещества с поверхностью рабочего стеклоугольного электрода, сопоставляласьзатем со стандартными растворами анализируемых веществ в заданных61концентрациях.
Стандартные растворы биогенных аминов и их предшественниковбыли предоставлены нам д.б.н. А.В. Олескиным. Величины концентрациймоноаминов в опытных образцах рассчитывали, исходя из отношений высотпиков в стандартной смеси и в исследуемом образце. Данная методика изложена вразнопрофильных работах, где она с успехом использовалась (Кудрин,Мирошниченко, Раевский, 1988; Яшин, Яшин, 2002; Шишов и др., 2009).Вся работа по определению биогенных аминов, их предшественников ипродуктов окислительного дезаминирования проводилась под руководством ипри участии специалиста в области жидкостной хроматографии к.м.н.
В.С.Кудрина(НИИфармакологииим.В.В.ЗакусоваРАМН,лабораториянейрохимической фармакологии, г. Москва) и д.б.н. А.В. Олескина (МГУ им.М.В. Ломоносова, Биологический факультет, г. Москва).Определение меланинов в экотолах2.4.Для опытов по определению меланинов были использованы экотолы,полученные из различного растительного сырья длительного срока хранения (7лет), а в случае экотола, полученного на основе пшеницы, наряду с экотоломдлительногохранения,былпроанализированэкотол,непосредственнополученный перед определением.Дляудалениялипидовлиофильновысушенныеобразцыэкотоловобрабатывали смесью гексан – изопропанол (1:1) при соотношении субстратрастворитель 1:10 в течение 24 ч, и фильтровали через капроновую мембрану.Остатки смеси растворителей удаляли на роторном испарителе при температуре30 °С.
Экстракцию пигментов проводили из обезжиренного сырья 0,1н NaOH при45 – 50 ºС в течение 2 ч, твердый остаток отделяли фильтрованием черезкапроновую мембрану. Щадящие условия выделения пигментов 0,1н NaOH итемпература, не превышающая 50 ºС, позволяли получить из образцов пигменты с62сохранением их структурно-функцональных свойств. Полученный фильтратподкисляли 1н HСl до pH 1,5, в результате чего пигмент образовывалхлопьевидный осадок, который отделяли центрифугированием в течение 15 минпри 10 000 g и растворяли в 0,1н NaOH. Процедуру кислотного переосажденияпроводили трижды, после чего полученный осадок растворяли в 0,01н NaOH идиализовали против воды до нейтральной рН.
Полученный препарат сушили налиофильной установке «Heto-Holten» (Дания).Идентификация выделенных пигментов проводилась по традиционнойсхеме, включающей комплексное исследование их растворимости, качественныхреакций на хиноны и фенолы, элементного состава, спектральных свойств.Одним из критериев отнесения пигментов к меланинам является ихнеспособность растворяться в органических растворителях и воде в сочетании срастворимостью в щелочных растворах.
Экстрагированные пигменты нерастворялись в большинстве органических растворителей: этаноле, изопропаноле,гексане, петролейном эфире, но растворялись в воде, диметилформамиде,концентрированных азотной и серной кислотах и щелочных растворах.Качественныереакциипоказали,чтоводныерастворыпигментовобесцвечивались H2O2, а в присутствии KMnO4 изменяли окраску с коричневой назеленую с последующим выпадением осадка.Добавление FeCl3 приводило квыпадению осадка, который растворялся в присутствии избытка FeCl 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
