Автореферат (1152192), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Идентичные с точки зрения продуцента, но полученныеразличными способами ФП характеризовались одинаковыми рН- и температурнымиоптимумами действия на аналогичных субстратах и составляли: для ПЕП – рН 4,0–5,0 и 50–55°С; для сериновой протеазы – рН 9,5–11,0 и 30–40°С; для ЛАП – рН 8,0–9,0 и 70°С; дляксиланазы – рН 3,5–4,5 и 55–65°С.Температурные и рН профили различных видов активности приведены на рисунке 6 (напримере промышленных ФП).
Исследуемые ферменты обладали следующими диапазонамидействия: ПЕП был активен при рН 3,0–5,5 и 30–60°С, ксиланаза – при рН 3,0–6,0 и 35–70°С,ЛАП – при рН 6,0–8,5 и 50–75°С, сериновая протеаза – рН 6,5–11,5 и 30–50°С.абРисунок 6 – рН- (а) и температурные (б) профили промышленных ферментныхпрепаратов ПЕП-П, ПЕП-ЛАП-П и Оризин-ПТермостабильность ферментов, входящих в состав ФП, определяли по остаточнойактивности после 90 мин инкубирования при температурах от 30 до 70°С и рН 6,5 (рисунок 7).Протеолитическая активность ФП ПЕП-П и ПЕП-ЛАП была стабильна при 30–50°С, притемпературе 60°С и выше стабильность уменьшалась; в случае ФП Оризин ПС была стабильнапри 30–40°С и уменьшалась при температуре 50°С и выше.
ЛАПА была стабильна притемпературе 30–40°С и уменьшалась при температуре 50°С и выше. Ксиланазная активностьвсех исследуемых ФП была стабильна при 30–50°С, но уменьшалась при температуре 60°С ивыше.15авбРисунок 7 – Остаточная ПС, ЛАПА и КсА для ФП (а) ПЕП-П, (б) ПЕП-ЛАП-П, (в) Оризинпосле инкубирования при температуре от 30 до 70°С в течение 90 мин (рН 6,5)ПС ПЕП и ПЕП-ЛАП – определяли по гемоглобину, ПС Оризин – по казеинату натрия, ЛАПА ПЕП-ЛАП – по Lлейцин-паранитроанилиду, КсА – по ксилану березы.Компонентный состав ФП был определён путём фракционирования с использованиемметода анионообменной хроматографии среднего давления (FPLC) на колонке с носителемSource 15Q. В таблице 3 представлен состав новых комплексных ФП.Таблица 3 – Компонентный состав ферментных препаратов, полученных на основерекомбинантных штаммов P.
canescens, а также на основе штамма-реципиентаСодержание компонентов ФП, % от общего количества белкаФПКсилААФ,AБФАБГЛПротеазыДругиеферментыИз штаммареципиента47352–5<19–15ПЕП-П20352–523 (ПЕП)17–20ПЕП-ЛАП-П18252–520(ПЕП – 16, ЛАП – 4)32–35Оризин15-2030225–30(сериновая протеаза)13–28Все исследованные ФП имели высокое содержание целевых рекомбинантных протеаз(ПЕП P. canescens, ЛАП A.
oryzae и сериновой протеазы A. oryzae) – в зависимости от препаратаоно составляло 20–25 % от общего пула белка. Все ФП имели относительно высокоесодержание КсилА – оно варьировало от 15 до 20% (отметим, что в случае ФП, полученного спомощью штамма-реципиента содержание КсилА составило 47%). Кроме того, ФП содержалиα-L-арабинофуранозидазу (АФ) и арабиноксилан-арабинофурано-гидролазу (АБФА) – их общеесодержание варьировало от 25 до 35%, а также β-1,3-глюканазу (БГЛ – 2–5%).Таким образом, исследованные ФП характеризовались высоким содержанием целевыхрекомбинантных протеаз, а также наличием в их составе комплекса гемицеллюлаз (изначальноприсущего штамму-реципиенту): ксиланазы, АФ, АБФА, а также БГЛ.163.3 Прикладные испытания новых ферментных препаратов3.3.1 Исследование эффективности применения препарата пенициллопепсина илейцинаминопептидазы для интенсификации спиртового броженияВ исследованиях по интенсификации спиртового брожения использовали комплексныйФП ПЕП-ЛАП-Л, содержащий кислую протеазу и лейцинаминопептидазу.
Для сравненияиспользовали коммерческий ФП Protoferm FP (кислая протеаза A. niger), который широкоприменяется в спиртовой промышленности для улучшения показателей сбраживаемого сусла.Активность протеаз указанных ФП представлена в таблице 4.Таблица 4 – Активность (ед./г) ферментных препаратов Protoferm FP и ПЕП-ЛАП-ЛПСЛАПАФПрН 4,7, 30ºСгемоглобинрН 5,0, 30ºСProtoferm FPПЕП-ЛАП-Л800601590130< 0,155030Эффективность применения ФП ПЕП-ЛАП в спиртовом брожении определяли методомпостановки бродильных проб по схеме, представленной в таблице 5.Таблица 5 – План постановки бродильных проб (АС – активность α-амилазы, ГлС – активностьглюкоамилазы)Тепловая обработкаОсахариваниеБрожениезамесаВариант1контроль1,5 ч при 80С2 ч при 85–88С1 ч при 58С68 ч при 34–35°С+0,6 ед.
АС/г крахм.+6 ед. ГлС/г крахм.–+0,6 ед. АС/г крахм.+6 ед. ГлС/г крахм.+0,1 ед. ПС/г сырьяФП Protoferm+6 ед. ГлС/г крахм. +0,1 ед. ПС/г сырьяФП Protoferm+6 ед. ГлС/г крахм.+0,1 ед. ПС/г сырьяФП ПЕП-ЛАП+6 ед. ГлС/г крахм. +0,1 ед. ПС/г сырьяФП ПЕП-ЛАП23+0,6 ед. АС/г крахм.+0,6 ед. АС/г крахм.45+0,6 ед. АС/г крахм.Полученные результаты (таблица 6) показали, что обработка пшеничного сусла ФППЕП-ЛАП, как на стадии осахаривания, так и на стадии брожения, позволила существенноинтенсифицировать процесс дрожжегенерации по сравнению с контролем, о чемсвидетельствуют основные показатели бражки (выделение СО2, количество дрожжевых клеток,концентрация несброженных углеводов и выход спирта).Низкие значения содержания несброженных углеводов в опытных вариантахсвидетельствуют о том, что применение ФП протеолитического действия позволило получитьболее глубоко выброженную бражку и увеличить выход спирта примерно на 1,13% об.
посравнению с контрольным вариантом (без ФП протеаз).Таблица 6 – Показатели сбраживания пшеничного сусла дрожжами S. cerevisiae 985Т с использованием ферментных препаратов Protoferm FPи ПЕП-ЛАП3ВариантКонтроль12ФПВыделение СО2, смДрожжимлн/см3/%почк.Концентрация несброженныхуглеводов, г/100 см368 чСр.у44 ч Ср.у* Собщ**Скр***V, %спиртВыходспирта из1ткрахмалаВыходспиртаиз 1 тсырья20 ч44 ч68 чАС терм. + ГлС5,29,112,969/10% почк.5,11,81,90,19,8760,234,7АС терм. + ГлС+ Protoferm FP6,312,315,182/12%3,30,450,50,0511,0666,638,47,614,415,184/14%0,850,40,460,0611,167,238,87,413,715,176/12%1,10,480,490,0110,9566,938,68,314,815,281/9%0,680,410,440,0311,1667,238,8На стадии осахаривания3АС терм. + ГлС+ Protoferm FPНа стадии брожения4АС терм. + ГлС+ ПЕП-ЛАПНа стадии осахаривания5АС терм.
+ ГлС+ ПЕП-ЛАПНа стадии брожения*Ср.у – массовая концентрация растворимых несброженных углеводов (моно-, ди- и олигосахариды, декстрины);**Собщ. – массовая концентрация общих несброженных углеводов;***Скр – нерастворенный крахмал, определяется по разности Скр = 0,9(Собщ – Ср.у).18При сравнении ФП ПЕП-ЛАП и ФП Protoferm FP можно заключить, что: 1)использование ФП ПЕП-ЛАП, как на стадии осахаривания, так и на стадии брожения сусла,позволило интенсифицировать процесс дрожжегенерации на начальных его этапах. Так, после20 ч сбраживания количество СО2, выделенное клетками дрожжей было выше, чем в варианте сФП Protoferm FP на 18 и 9%, соответственно, после 44 ч сбраживания сусла это преимуществосоставило 11 и 3%, соответственно. По окончанию процесса брожения (68 ч) показатели повыделению СО2, при использовании обоих ФП практически сравнялись; 2) выход спирта придобавлении исследуемых ФП протеаз на стадии брожения был одинаков и составил 67,2, что на7 Дал больше, чем в контрольном варианте без использования протеаз.Таким образом, ФП ПЕП-ЛАП, полученный на основе нового рекомбинантного штаммаP.
canescens RN3-11-7-7, может выступать в качестве более дешёвого аналога импортному ФПProtoferm FP. Применение препарата ПЕП-ЛАП в спиртовом производстве позволитсущественно сократить продолжительность брожения за счет ускорения процесса напервоначальной стадии, а наличие ксиланазы будет способствовать улучшению реологическихсвойств сусла, снижая его вязкость. Использование нового комплексного ФП позволит снизитьрасходы на производство и обеспечить безопасную эксплуатацию оборудования.3.3.2 Результаты испытаний in vitro ферментного препарата Пенициллопепсина вкачестве кормовой добавки на зерновом сырьеДля оценки эффективности ФП ПЕП-Р было выбрано зерновое сырьё, которое наиболеечасто применяется в кормопроизводстве для моногастричных животных и птицы как источниккрахмала и белка: рожь, пшеница и тритикале.
Результаты действия ФП in vitro на зерновоесырьё оценивали по образованию водорастворимого белка и ВС в реакционной смеси. Длясравнения были выбраны коммерческие препараты, которые в настоящее время широкоиспользуются в кормовой промышленности: ФП ксиланазы – Палпфор 2 и кислой протеазы –Acid Protease. Характеристики этих ФП, а также ПЕП-Р представлены в таблице 7. Отметим,что ФП Палпфор 2 имел практически одинаковую с ФП ПЕП-Р ксиланазную активность, но неимел протеазной активности; напротив, ФП Acid Protease имел одинаковую с ФП ПЕП-Ппротеазную активность, но не обладал ксиланазной и БГЛ активностями.Таблица 7 – Содержание белка (мг/г) и активности (ед./г) ферментных препаратов,использованных для гидролиза зерновых субстратовПСКсАБГЛФПБелокрН 4,7, 30°СгемоглобинПЕП-РПалпфор 2Acid Protease15612133151681365080< 0,167060рН 5,0, 50°СрН 5,0, 50°С1220901250120< 0,1975242< 0,1Полученные результаты (рисунок 8), свидетельствуют об увеличении выходаводорастворимого белка и ВС после действия на используемые субстраты всеми исследуемымиФП.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
