Автореферат (1152192), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Созданы методами генетической инженерии новые стабильные высокоактивныерекомбинантные штаммы-продуценты грибных протеаз с различной специфичностью действия:P. canescens Pep-4 – продуцент кислой аспартатной протеазы – пенициллопепсина; P. canescensRN3-11-7-7 – пенициллопепсина и лейцинаминопептидазы; P. canescens Oryzin-25 – грибнойсериновой протеазы – оризина. Новые штаммы характеризуются тем, что базовый уровеньбиосинтеза собственного комплекса гемицеллюлаз штамма P. canescens практически неизменился.2.
Технология производства комплексных ФП протеаз и гемицеллюлаз успешномасштабирована в условиях завода ООО «Агрофермент», что обеспечило получениепромышленных партий этих ФП.3. Новые штаммы-продуценты позволили обеспечить содержание рекомбинантных протеаз впромышленных ФП ПЕП (пенициллопепсин) и ПЕП-ЛАП (пенициллопепсин и6лейцинаминопептидаза) и лабораторном ФП Оризин 20–25% от общего пула белка, ксиланазы –15–20%, α-L-арабинофуранозидазы и арабиноксилан-арабинофураногидролазы – 25–30%, β-1,3глюканазы – 2–5%, т.е.
получить комплексные ФП, в состав которых входят протеазы игемицеллюлазы.4. ФП протеолитического действия ПЕП-ЛАП (пенициллопепсин и лейцинаминопептидаза)успешно использован для интенсификации процесса дрожжегенерации спиртовогопроизводства и увеличения выхода спирта из пшеничного сусла по сравнению с контролем.5. Комплексные ФП протеаз и гемицеллюлаз успешно использованы в качестве кормовыхдобавок для откормочного молодняка свиней.Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Диссертациясоответствует пунктам 4, 7 и 15 паспорта специальности 05.18.07 – «Биотехнология пищевыхпродуктов и биологически активных веществ».Степень достоверности результатов. Достоверность результатов диссертационногоисследования и сделанных выводов подтверждается использованием современных методовисследований, которые соответствуют поставленным в работе целям и задачам.
Научныеположения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, подкрепленыданными, представленными в таблицах и рисунках. Статистическую обработку данныхпроводили с доверительной вероятностью 0,95 в программе Microsoft Office Excel.Личный вклад диссертанта. Автор лично проводил сбор и анализ литературныхданных, осуществлял планирование и проведение научных экспериментов, обработку иинтерпретацию полученных данных, а также подготовку материалов научных публикаций.Апробация результатов работы. Результаты работы представлены на российских имеждународных конференциях и симпозиумах: 7 и 8 Московских международных конгрессах«Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013, 2015); InternationalConferences «Biocatalysis-2013» и «Biocatalysis-2015: fundamentals and applications» (Москва,2013, 2015); II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых иаспирантов «Научное обеспечение инновационных технологий производства и хранениясельскохозяйственной и пищевой продукции» (Краснодар, 2014); VII Международном научнопрактическом симпозиуме «Перспективные биотехнологические процессы в технологияхпродуктов питания и кормов» (Москва, 2014); IX Международной научной конференции«Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Минск, 2015); 8-мМеждународном научно-практическом симпозиуме «Перспективные ферментные препараты ибиотехнологические процессы в технологиях продуктов питания и кормов» (Москва, 2016); Vсъезде физиологов СНГ и V съезде биохимиков России (Дагомыс, 2016); V международнойнаучно-практическая конференция «Биотехнология: наука и практика» (Ялта, 2017); Научнопрактическом семинаре «Современные биотехнологические процессы, оборудование и методыконтроля в производстве спирта и спиртных напитков» (Москва, 2017).Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ, 2 статьи в других научных изданиях, а также 6 тезисов и 5 статей в сборниках материалов конференций, получено два патента РФ.7Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзоралитературы (глава 1), описания объектов исследования и методов экспериментов (глава 2),изложения результатов и их обсуждения (глава 3), выводов, списка используемой литературы(143 источника) и приложения. Объем диссертации составляет 151 страницу и включает 30рисунков и 35 таблиц.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВВ обзоре обобщены данные о классификации, структуре и свойствах протеолитическихферментов, описан механизм их действия, а также основные продуценты. Приведены состав истроение основных видов белоксодержащего растительного сырья, показана перспективностьприменения протеолитических ферментов при переработке растительного сырья в различныхотраслях АПК.
Рассмотрены способы повышения продуктивности мицелиальных грибов сиспользованием методов генной инженерии, описаны этапы создания штамма-реципиента P.canescens как универсальной платформы для получения новых рекомбинантных штаммов.Анализ литературных данных позволил выявить проблемы, существующие в данной области, исформулировать цель и задачи настоящего исследования.2 ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВВ данной главе описаны использованные материалы и методы экспериментов.Исследования проводили в лабораторных условиях ВНИИПБТ – филиала ФГБУН «ФИЦпитания и биотехнологии», ФИЦ Биотехнологии РАН, ИБФМ им. Г.К.
Скрябина РАН –подразделение ФИЦ ПНЦБИ РАН (г. Пущино), кафедры химической энзимологии МГУ имениМ.В. Ломоносова; в производственных условиях завода ООО «Агрофермент» (Тамбовскаяобл.); испытания ФП in vivo проводили в условиях племзавода «Орловский» (Тамбовская обл.).Для создания новых продуцентов использовали штамм-реципиент P.
canescens RN3-11-7niaD . Споровый посевной материал штаммов получали и хранили на среде SM следующегосостава (% масс.): глюкоза – 1,0, КН2РО4 – 1,0, дрожжевой экстракт – 0,5, агар-агар – 2,0,штамм выращивали 7 суток при 30°С. Для глубинного культивирования штаммов использовалиферментационную среду следующего состава (% масс.): соевая шелуха – 4,5, кукурузныйэкстракт – 5,0, KH2PO4 – 2,5. Культивирование продуцентов осуществляли в колбахЭрленмейера объемом 750 см3 в 100 см3 ферментационной среды на ротационной качалке (240об/мин) при 30°С в течение 144 ч.
Культуральную жидкость (КЖ) отделяли от мицелияцентрифугированием в течение 10 мин при 13500 об/мин.Протеолитическую активность (ПС) определяли по модифицированному методу Ансона,который основан на гидролизе гемоглобина (или казеината натрия) исследуемым ФП донизкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот с последующим осаждениемнепрогидролизованного белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ) и определением образовавшихпептидов и свободных аминокислот. Метод определения протеолитической активности HUT(Hemoglobin Units of Tyrosine basis, Food Chemical Codex) основан на гидролизе гемоглобина8при рН 4,7 и 40°С в течение 30 минут с последующим осаждением непрогидролизованногосубстрата ТХУ.
Метод ФОЛП основан на гидролизе казеина в течение одного часа притемпературе 40ºС, рН 10,5. Активность лейцинаминопептидазы (ЛАПА) определяли погидролизу субстрата L-лейцин-п-нитроанилида в течение одного часа с высвобождением паранитроанилина при температуре 30ºС и рН 5,0. Ксиланазную (КсА) и β-глюканазную (БГЛ)активности определяли методом Шомоди-Нельсона, основанным на измерении скоростиобразования восстанавливающих сахаров (ВС) при гидролизе, соответственно, ксилана березыи β-глюкана ячменя при температуре 50ºС и рН 5,0. Содержание белка определяли по методуЛоури.Изучение качественного состава ФП осуществляли с помощью электрофореза вполиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДДС-ЭФ).
Компонентный состав ФПопределяли с помощью анионообменной хроматографии.Для сравнительного анализа в работе использовали импортные коммерческие ФП:кислую протеазу Protoferm FP (Shandong Longda Bio-Products Co., Ltd.) и Acid Protease (BeijingChallenge Bio-technology Limited company), а также ксиланазу Палпфор 2 (ООО«Микробиопром»).Основные этапы исследований выполнялись в соответствии со схемой, представленнойна рисунке 1.Штамм P. canescens RN3-11-7 niaDКотрансформацияштамма плазмидамиpPrXEG_PEPpPrAbf_LapПолучение штаммаP.
canescens RN3-11-7-7Трансформацияштамма плазмидойpPrXEG_PEPПолучение штаммаP. canescens Pep-4Котрансформацияштамма плазмидамиpPrXEG_PEPpPrAbf_Lap1pPrXEG_alcPr_AorПолучение штаммаP. canescens Oryzin-3Трансформацияштамма плазмидойpPrXEG_alcPr_AorПолучение штаммаP. canescens Oryzin-25Исследование стабильности полученных рекомбинантных штаммов при пересевахПолучение лабораторных и промышленных образцов ФПИзучение физико-химических свойств ФППрикладные испытания ФП на белоксодержащем растительном сырьеIn vitro “кормовые”испытания ФП назерновом сырьеИнтенсификацияспиртового броженияIn vitro “кормовые” испытанияФП на бобовом сырьеИспытания ФП in vivo напродуктивность свиней при откормеРисунок 1 – Структурная схема экспериментальных исследований93 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Получение рекомбинантных штаммовДля получения продуцентов протеолитических ферментов были проведенытрансформации штамма-реципиента P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
