Автореферат (1152192), страница 3
Текст из файла (страница 3)
canescens RN3-11-7 niaD- одной плазмидой иликомбинацией двух и трех целевых плазмид совместно с маркерной котрансформационнойплазмидой pSTA10 (niaD+). Соотношение целевых плазмид и pSTA10 составляло 10:1.В опытах использовали следующие плазмиды, созданные совместно с ФИЦБиотехнологии РАН (рисунок 1):pPrXEG_PEP, несущую целевой ген пенициллопепсина (pepA) P. canescens подконтролем индуцибельного промотора ксиланазы А гриба P.
canescens;pPrAbf_Lap1, несущую целевой ген лейцинаминопептидазы (lap1) A. oryzae подконтролем индуцибельного промотора α-L-арабинофуранозидазы P. canescens;pPrXEG_alcPr_Aor, несущую целевой ген сериновой протеазы A. oryzae (alp) подконтролем индуцибельного промотора ксиланазы А P. canescens.абвРисунок 1 – Схематичное изображение экспрессионных кассет плазмид pPrXEG-PEP(а),pPrABF-LAP(б) и pPrXEG_alcPr_Aor (в)В результате были получены следующие рекомбинантные штаммы: P.
canescens Pep-4 –продуцент пенициллопепсина (ПЕП); P. canescens RN3-11-7-7 – продуцент ПЕП илейцинаминопептидазы (ЛАП); P. canescens Oryzin-25 – продуцент щелочной сериновойпротеазы – Оризина.Полученные трансформанты культивировали в качалочных колбах на стандартнойферментационной среде штамма P. canescens, в КЖ определяли концентрацию белка и целевыеактивности: ПС (используя гемоглобин или казеинат натрия в качестве субстратов), активностьлейцинаминопептидазы (ЛАПА), а также базовую ксиланазную активность (КсА), изначальноприсущую штамму-реципиенту. В результате были отобраны наиболее перспективные с точкизрения уровня целевых и базовой активностей трансформанты (активность в КЖ приведена втаблице 1).10Таблица 1 – Активности (ед./см3) и концентрация белка (мг/см3) в культуральной жидкости,полученной в результате культивирования новых рекомбинантных штаммов-продуцентов,созданных на основе штамма-реципиента P.
canescens RN3-11-7 niaD- (качалочные колбы, 144 ч,30°С)ПСШтаммКонтрольP. canescensRN3-11-7 niaDP. canescensPep-4P. canescensRN3-11-7-7P. canescensOryzin-25ПлазмидыБелокрН 4,7, 30ºСгемоглобинрН 10,0, 40ºСказеинатнатрияЛАПАКсАрН 5,0, 30°CрН 5,0, 50°С–911,00,2<1<125030pPrXEG_PEP17211010––23020pPrXEG_PEP,pPrAbf_Lap1141643–25223020pPrXEG_alcPr_Aor192–221–24010ПС штамма P. canescens Pep-4 – продуцента ПЕП, относительно контроля (штаммареципиента) возросла в 110 раз; штамма P. canescens RN3-11-7-7 – продуцента ПЕП и ЛАП – в64 и 25 раз соответственно; активность щелочной сериновой протеазы штамма P.
canescensОryzin-25 – в 22 раза, при этом рекомбинантные штаммы сохранили уровень биосинтезасобственной ксиланазы, что является важным свойством при получении комплексных ФП.На рисунке 2 приведены электрофореграммы образцов КЖ, полученных в результатекультивирования в качалочных колбах, которые характеризовались присутствием полос,соответствующих молекулярной массе целевых белков ПЕП (43 кДа, рис.
2а и 2б), ЛАП (37кДа, рис 2б) и Оризину (37 и 27 кДа, рис. 2в), а также КсилА (30 кДа).Рисунок 2 – Результаты ДДС-ЭФ культуральной жидкости рекомбинантных штаммовP. canescens Pep (а), P. canescens RN3-11-7 (б) и P. canescens Oryzin (в)Таким образом, с помощью методов генной инженерии с использованием штаммареципиента P. canescens RN3-11-7 niaD-, были созданы следующие рекомбинантные штаммы: врезультате трансформации плазмидой pPrXEG_PEP – P. canescens Pep-4 – высокоактивныйпродуцент ПЕП; в результате котрансформации плазмидами pPrXEG_PEP и pPrAbf_Lap1 – P.canescens RN3-11-7-7 – продуцент комплекса эндо- и экзопептидаз – ПЕП и ЛАП; в результатетрансформации плазмидой pPrXEG_alcPr_Aor – P.
canescens Oryzin-25 – продуцент сериновой11протеазы. Следует отметить, что ксиланазная активность новых рекомбинантных штаммовпрактически не изменилась по сравнению со штаммом-реципиентом.3.1.1 Стабильность рекомбинантных штаммовИсследования стабильности новых рекомбинантных штаммов – продуцентов целевыхферментов включали выбор состава агаризованной среды, обеспечивающей сохранениевысокого и постоянного уровня биосинтеза ферментов при последовательных пересевах, атакже равномерный рост мицелия и накопление достаточного количества биомассы гриба.Последовательные пересевы штаммов (рисунок 3) осуществляли на трех видах агаризованныхсред: на минимальной среде РМ+NaNO3, применяемой для отбора трансформантов, среде SM,содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и KH2PO4, и среде СА, в состав которой входилоагаризованное сусло плотностью 7°Б.Рисунок 3 – Схема пересева рекомбинантных штаммов P.
canescensПолученные результаты показали, что оптимальной агаризованной средой для веденияпосевного материала рекомбинантных штаммов P. canescens является среда SM: посевнойматериал, выращенный на данной среде, при культивировании в качалочных колбахобеспечивал высокие и стабильные результаты по биосинтезу целевых ферментов прикультивировании на жидких средах. Кроме того, гигантские колонии, выращенные на средеSM, имеют более интенсивное спороношение по сравнению с колониями на среде СА ихарактеризуются обильным накоплением биомассы по сравнению с минимальной средойРМ+NaNO3, что свидетельствует об оптимальном физиологическом развитии гриба на средеSM (рисунок 4).Далее была определена стабильность рекомбинантных штаммов при длительномхранении посевного материала на выбранной агаризованной среде SM по признаку биосинтезапротеаз.
Штаммы хранили на скошенном агаре при температуре +4°С в течение 1,5 лет споследовательным пересевом на чистые среды через каждые 3 месяца.12Рисунок 4 – Гигантские колонии рекомбинантных штаммов P. canescens Pep-4 (а),P. canescens RN3-11-7-7 (б) и P. canescens Oryzin-25 (в) при росте на различных агаризованныхсредах (144 ч, 30ºС)После каждого пересева штаммы тестировали при глубинном культивировании нажидких средах в качалочных колбах, в КЖ определяли активность по отношению кгемоглобину (в случае штаммов Pep-4 и RN3-11-7-7), казеинату натрия (в случае Oryzin-25) и Lлейцин-паранитроанилиду (в случае RN3-11-7-7). Результаты представлены на рисунке 5.Рисунок 5 – Влияние последовательных пересевов на агаризованной среде SM посевногоматериала рекомбинантных штаммов P.
canescens на биосинтез протеаз при глубинномкультивировании (качалочные колбы, 144 ч, 30ºС)Рекомбинантные штаммы сохраняли уровень активности протеолитических ферментовпосле 5 пересевов в течение 1,5 лет, что свидетельствуют об их стабильности по признакубиосинтеза протеаз при использовании агаризованной среды SM для хранения посевногоматериала.133.2 Получение ферментных препаратов на основе новых рекомбинантных штаммовP. canescens, изучение их свойств и компонентного составаДля получения лабораторных образцов ФП рекомбинантные штаммы культивировали вкачалочных колбах и лабораторных ферментерах объемом 3 и 10 дм3.
КЖ после завершенияпроцесса ферментации использовали для получения сухих ФП с помощью различных методов.Промышленные образцы комплексных ФП получали на заводе ООО «Агрофермент»(Тамбовская обл.), где были успешно проведены производственные испытания процессакультивирования новых рекомбинантных штаммов в промышленных ферментерах объемом 10м3 и были получены партии гранулированных ФП.Промышленные образцы ФП соответствовали санитарно-микробиологическимпоказателям безопасности в соответствии с ТР ТС 029/2012.Перечень всех полученных ФП приведена в таблице 2.Таблица 2 – Лабораторные и промышленные образцы ферментных препаратов* на основеновых рекомбинантных штаммов P.
canescensШтаммНазвание ФППЕП-АP. canescens Pep-4ПЕП-РПЕП-ППЕП-ЛАП-АP. canescensRN3-11-7-7ПЕП-ЛАП-ЛПЕП-ЛАП-ПОризин-АP. canescensOryzin-25Оризин-ПP. canescens Pep-4+P. canescensOryzin-25МЭК-АМЭК-ПСпособ полученияЛабораторный образецКачалочные колбыОсаждение КЖ ацетономЛабораторный образец10 дм3 ферментерРаспылительная сушка УКПромышленный образец10 м3 ферментерРаспылительная сушка УКЛабораторный образецКачалочные колбыОсаждение КЖ ацетономЛабораторный образец3 дм3 ферментерЛиофильная сушка УКПромышленный образец10 м3 ферментерРаспылительная сушка УКЛабораторный образецКачалочные колбыОсаждение КЖ ацетономПромышленный образец10 м3 ферментерРаспылительная сушка УКЛабораторный образецСмесь сухих ФП ПЕП-А и Оризин-А всоотношении 1:1Промышленный образецСмесь сухих промышленных ФП ПЕП-Пи Оризин-П в соотношении 1:1,5Место полученияЛабораторияВНИИПБТИБФМ РАНЗаводООО «Агрофермент»ЛабораторияВНИИПБТЦКП ФИЦБиотехнологии РАНЗавод ООО«Агрофермент»ЛабораторияВНИИПБТЗаводООО «Агрофермент»ЛабораторияВНИИПБТЗаводООО «Агрофермент»*Активности и содержание белка в ФП указаны ниже в разделе 3.3 «Прикладные испытания новых ферментныхпрепаратов».Для полученных ФП определены некоторые физико-химические свойства, а такжекомпонентный состав.14рН и температурные профили определяли по гемоглобину (в случае ФП ПЕП и ПЕПЛАП), казеинату натрия (в случае ФП Оризин), L-лейцин-паранитроанилиду (в случае ФППЕП-ЛАП), ксилану – для всех ФП.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
