Диссертация (1151487), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Однако в рамках доклинических испытаний РФПдля большинства камер используется моноэкспоненциальная функция тольковыведения(неучитывающаябыстройаккумуляции),чтоявляется,несомненно, серьезным упрощающим допущением, но достаточным на такомэтапе исследований.78Следует отметить, что зачастую быструю аккумуляцию удобнодифференцировать в линейную функцию, что значительно упрощает процессее последующего интегрирования.2.3.3.Расчетбиологическихиэффективныхпериодовполувыведения 68Ga-цитратаПолученные константы скоростей (по п. 2.3.2) могут быть полезны длярасчета биологических (6) и эффективных (7) периодов полувыведения 68Gaцитрата из разных камер.
=2(6)где – биологический период полувыведения РФП, ч; –константа скорости биологического выведения, ч-1.Учитывая формулу (3), эффективный период полувыведения ,отражающий время, за которое радиоактивность в камере снижается вдвое,можно описать, как: = ∙ ℎ + ℎ(7)где ℎ – физический период полураспада изотопа галлия (длягаллия-67 – 78,26 ч, для галлия-68 – 1,13 ч).Следуетотметить,чтосравниватьэффективныепериодыполувыведения для двух исследуемых РФП нецелесообразно, так как периодполураспада галлия-68 почти в 70 раз меньше, чем у галлия-67.2.3.4.
Визуализация смоделированных воспалительных процессовметодом позитронно-эмиссионной томографииВизуализация смоделированных воспалительных процессов методомпозитронно-эмиссионной томографии направлена на их индикацию, чтобывизуально подтвердить или опровергнуть их смоделированную локализацию(по п. 2.2.1-2.2.4), и полученные по п. 2.3.1 количественные данные онакоплении-выведении 68Ga-цитрата с различными типами введения.Мышей (60 шт., массой 20,3±1,7 г) с каждым из четырех типов79воспаления (по п. 2.2.1-2.2.4) делили на три группы (по 20 шт.) по принципуразличного типа введения:А. внутривенное введение мышам только РФП68Ga-цитрата в объеме0,10±0,01 мл с активностью не более 20 МБк/мл (группа А);Б. внутривенное введение мышам раствора цитрата железа (III) в объеме0,10±0,01 мл (по п. 2.1.3) за 10-15 минут до введения РФП68Ga-цитрат(группа Б);В.
внутривенное введение мышам РФК68Ga- и Fe-цитратав объеме0,10±0,01 мл с активностью не более 20 МБк/мл (группа В).Дизайнисследованияповизуализациисмоделированныхвоспалительных процессов у мышей методом ПЭТ представлен в таблице 4.РФП и/или РФК вводили лабораторным животным однократно, внутривеннов хвостовую вену в объеме 0,1 мл с активностью не более 2 МБк/мышь.Визуализацию смоделированных воспалительных процессов проводили напозитронно-эмиссионном томографе PET/X-RAY Genisys4 (SofieBioscience,USA) для лабораторных животных PETBox.
Процедуру сканированиявыполняли через 30, 60 и 120 минут после внутривенной инъекции. Времясканирования 10 минут.Таблица 4. Дизайн исследования по визуализации смоделированныхвоспалительных процессов у мышей методом ПЭТГруппы мышей попринципу различноготипа введенияАБВТолько 68GaцитратПредварительноцитрат железа(III), затем 68GaцитратРФК 68Ga- и Feцитрата(совместно)Количество мышей с определенным видом воспаления, шт.АсептическоеСептическоеЗаболеваниеСептическийвоспалениевоспалениевоспаленногоостеомиелитмягких тканейлегкихкишечника555555555555Всего животных, шт.:6080ПЭТ-сканерPET/X-RAYGenisys4состоитизчетырехпанелейдетекторов, каждая из которых имеет 24×50 кристаллов германата висмута(вместо стандартных из оксиортосиликата лития), с размерами кристалла1,8×1,8×7,0 мм, соединенными между собой ФЭУ H8500 (Hamamatsu).
Всегов поле измерения 4800 кристаллов, регистрирующих энергию излучения 150650 кэВ в площади окна 9,4×4,4 см с пиком чувствительности в центре поля14%. Пространственное разрешение одного воксела 1,35±0,03 мм. Сканерпозволяетконтролироватьингаляционную анестезию изофлураном всочетании с кислородом (500 мл/ч) и температуру подложки мыши длябиологическойстабильностиибезопасностиживотноговтечениесканирования. Для облегчения 3D-реконструкции КТ-изображения мышиGenisys4 обеспечивает автоматический подбор на 99,9% похожего КТизображения мыши из атласа MARS (Mouse Atlas Registration System) (WangH.
et al., 2012).2.3.5. Реконструкция и анализ изображенийВыходной файл формата *.dicom использовался для его последующейколичественной обработки в программе VivoQuant версии 2.35 и дляполучения читаемых изображений с фильтрами INVERT (black and white) иNIH (rainbow). Программа позволяет рисовать зоны интереса 3D ROI (regionsof interest), определять в них накопление активности радионуклида ирассчитывать стандартизованные коэффициенты накопленияSUV (8)(standardized uptake value) для ROI, г/мл: ==∙=%100%∙,(8)где – концентрация накопленной активности в объеме органа , МБк/мл; – концентрация введенной активности во всем теле (background), МБк/г; % – процент накопленной активности в органе отобщей введенной активности.
Физический смысл SUV (8) заключается впредоставлении информации об аномальном накоплении препарата в ROI поотношению к общему распределению во всем теле. Чем больше коэффициент81SUV отличен от единицы (SUV>1), тем контрастнее визуализируется областьинтереса ROI. Зная SUV, можно найти процент накопленной активности, инаоборот.Клиренс крови CL отражает элиминацию радиофармпрепарата путемего биотрансформации и выведения из крови. Чем больше значение клиренсакрови (9), тем быстрее препарат покидает кровоток. Допустим, препаратвыводится из крови экспоненциально, согласно моноэкспоненциальнойфункции () = 0 ∙ − , то площадь под кривой AUC (area under curve),показывая накопленную активность (10), может быть использована длярасчета клиренса крови: =∞ = ∫ () ∙ =0(9)0(10)где 0 – угловой коэффициент; – константа скорости выведения,подбирающиеся методом наименьших квадратов (методом Рунге-Кутты по п.2.3.2.).
Зная клиренс крови, можно найти объем биораспределения (11),который показывает, какой объем займет введенный радиофармпрепарат стекущей концентрацией в крови: чем ниже концентрация, тем больше объембиораспределения. =(11)где – эффективная константа скорости крови, показывающаявремя, за которое радиоактивность в крови уменьшается вдвое.822.4.Методыисследованияприготовления РФП68безопасностилиофилизатовдляGa-цитрата и раствора цитрата стабильногожелеза (III)Целью исследования безопасности применения РФП является выявлениеиоценкавыраженноститоксическихэффектов,возникающихпривзаимодействии лиофилизатов с организмом лабораторных животных.Важным отличием РФП от обычных фармацевтических препаратов являетсяналичие радиоактивной метки, что предполагает токсикологическую оценкубезопасности не только нерадиоактивных компонентов препарата, но иоценкутоксическихпобочныхэффектовотпрямогодействияионизирующего излучения.
Однако проводить исследования по оценкетоксичности для препарата, меченного короткоживущим радионуклидом (вчастности, галлием-68; период полураспада 1,13 ч), нецелесообразно,поскольку, даже если бы РФП не выводился из организма естественнымипутями, то через 10 ч после введения в организме оставалось бы около 0,2%(для галлия-68) от первоначально введенной радиоактивности. Оценкатоксических побочных эффектов от прямого действия ионизирующегоизлучения называется оценкой радиационной безопасности и заключается вдозиметрическом расчете поглощенных и эффективных доз, формируемых68Ga-цитратом в организме человека (п.
2.4.4).Объем исследований безопасности определен, согласно МУ 2.6.1.046-2013 «Доклинические исследования радиофармацевтических препаратов дляпозитронно-эмиссионной томографии», утв. 4.07.2013 г. ФМБА России, иРуководству по проведению доклинических исследований лекарственныхсредств(МироновА.Н.,2012).Дизайнисследованиябезопасностилиофилизатов отражен в таблице 5 (без исследования специфическойбезопасности).83Таблица5.ДизайнисследованиябезопасностилиофилизатовдляКонтрольЦ*ЭДФ*ЦЭДx5ФЦЭДx10ФЦЭДx20ФЦЭДx40ФЦЭДx50Ф8,01,89,180,418,2160,836,472,8402,191,0Всегоживотных,шт.ОстраяАллергезирующеетоксичностьдействие♂55555555555♀55555555555110♂555-♀555-Доза, мг/кгЛабораторные животные для исследования безопасностикрысы линиимыши линии BALB/c, шт.Sprague Dawley, шт.Доза, мг/кгВводимыедозировкирастворовлиофилизатовприготовления 68Ga-цитратаСубхроническаятоксичность**♂525252525-3,70,837,18,4-30♀525252525-210140* Ц – Цигалин, Ф – Фероцит** Каждая группа по 25 крыс разделена на 5 временных точек (0, 5, 10, 15, 21 сутки) по 5крыс на точку2.4.1.
Исследование острой токсичности лиофилизатовИсследование проводили на мышах линии BALB/c, самки и самцы,массой 21,0±1,0 г (110 шт.: 50 шт. для Цигалина, 60 шт. для Фероцита). Вцеляхисследованияживотныхраспределялинаконтрольнуюиэкспериментальные группы с расчетом увеличения вводимых доз (формула 1,по п.
2.1.4), эквивалентных предполагаемой однократной для человека (ЭД),по 5 особей в группе для каждого пола, согласно дизайну исследований84(табл. 5).Объем внутривенно вводимого раствора лиофилизата составил 0,1мл/мышь. Животным контрольной группы вводили 0,1 мл 0,9% растворхлорида натрия. Критериями оценки острой токсичности являлись: выживаемость и смертность (расчет LD50 с использованием методалогит-регрессии); внешний вид и поведение; реакция на внешние раздражители; болевая реакция; потребление корма и воды; количество и консистенция фекальных масс; частота мочеиспускания и цвет мочи.Наблюдение за тест-системами осуществляли на протяжении 14календарных дней.
В день введения разных дозировок наблюдениеосуществляли через каждые 2 часа на протяжении 8 часов. В течениепоследующих дней исследования наблюдение за каждым животнымпроводили дважды в день (утром и вечером).По окончании наблюдения всех выживших животных выводили изэксперимента путем декапитации и проводили некропсию с последующимвычислением абсолютной и относительной массы органов на весах Vibra(Shinko Denshi Co Ltd, Япония).
Технику патологоанатомического вскрытияживотных проводили согласно протоколу, разработанного Елизаровой О.Н.(Елизарова О.Н. и др., 1974).2.4.2. Исследование хронической токсичности лиофилизатовИсследование проводили на крысах линии Sprague Dawley массой тела192,1±17,8 г (210 шт.: по 105 шт. для каждого лиофилизата). Методомслучайной выборки с учетом массы тела и пола в качестве определяющегопоказателя были сформированы контрольная и экспериментальные группы,согласно дизайну исследований (табл.
5).85Объем вводимого внутривенно раствора лиофилизата составил 0,2 мл.Животным контрольной группы вводили 0,2 мл 0,9% раствор хлориданатрия. Критериями оценки хронической токсичности являлись: выживаемость; визуальная оценка общего состояния исследуемых животных; результаты общего клинического анализа крови; результаты биохимического анализа крови; патоморфологическое исследование.Общий клинический анализ крови проводили на автоматическомгематологическом ветеринарном анализаторе Exigo 17 (Boule Medical,Швеция) с использованием пластиковых микропипеток на 30 мкл сантикоагулянтом ЭДТА-К2.Биохимический анализ крови проводили на полуавтоматическомбиохимическом анализаторе StatFax 4500+ (США) с использованиемстандартных наборов реагентов UTS (Юнимед, Россия) и пробирок сактиватором свертывания (Sarstedt, Германия).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
