Диссертация (1151313), страница 34
Текст из файла (страница 34)
halobium (солёная рыба, засоленные шкуры животных, рассолы, природные высокосолёныеозёра, а также Мёртвое море).Строение клеточной стенки этих организмов значительно отличается друг от друга.Грамотрицательные бактерии A. fischeri характеризует многослойная структура клеточнойстенки, обеспечивающая значительную стабильность к внешним воздействиям. Клеточныепокровы бактерии состоят из цитоплазматической мембраны, пептидогликанового слоя,образующегои наружнойвнутренниймембраны —слойклеточнойстенки,дополнительного слояпериплазматическогоклеточной стенки —пространствасостоящего изфосфолипидов, белков, липопротеина, липополисахарида сложного строения (30–40%поверхности наружной мембраны); в небольших количествах муреин.
Клетки бактерииспособны выживать даже в условиях замораживания и оттаивания.У археи H. halobium в составе клеточных покровов отсутствует пептидогликановый слой.Мембраны состоят из липидного монослоя, окружённого S-слоем из гликопротеина, в составекоторого найдены около 50% белков клеточных покровов. Обычным липопротеиновыммембранам не хватает высоких концентраций соли для сохранения формы клетки.
Бислоймембраны археи построен из полярных липидов — изопрениловых диэфиров фосфоглицеринас небольшим содержанием неполярных липидов — с30-изопреноидов — и указанным большимсодержанием белков. Это сенсорные белки, в частности бактериородопсин, выполняющийфункции АТФ-зависимой транслоказы [130, 340]. Бактериородопсин — светочувствительныйбелок, снабжающий клетку химической энергией, используя солнечный свет для протонныхпомп из клетки. В результате архея использует протонный градиент через мембрану для контролясинтеза энергетического переносчика АТФ. Таким образом, строение и состав клеточныхпокровов археи так же, как и в случае люминесцирующей бактерии свидетельствуют обустойчивости их клеток к изменениям окружающих условий.Обе опытные микробные культуры — хемоорганотрофы, предпочитают для ростав качестве источников химической энергии аминокислоты, пептон, глицерин, но не сахара.
Оба163объекта исследований обладают уникальными биохимическими функциями: A. fischeri —функцией свечения, H. halobium — функцией бактериального фотосинтеза. Бактерии способнык детоксикации активных форм кислорода, имеют высокое родство к кислородному субстрату,активирующему свечение даже при низкой концентрации О2 [89]. Археи в зависимости отусловий (свет или темнота), наличию в небольших концентрациях кислорода и усвояемыхорганических соединений могут быть по типу источника энергии фототрофами, обладающимизащитными механизмами активного транспорта ионов, предотвращающих осмотический стрессв условиях высокой солёности среды.Благодаря своим уникальным свойствам A.
fischeri и H. halobium широко используютсяв качестве модельных организмов не только в биохимических и генетических исследованиях, нои в исследованиях по функциональной геномике.§ 14.1. Действие пероксида водорода, температуры, pH и белков наинтенсивность люминесценции Aliivibrio fischeriСогласно полученным результатам исследований, вносимый в инкубационную средупероксид водорода способен и стимулировать, и подавлять биохемилюминесценцию бактерийA. fischeri в зависимости от концентрации H2O2.
При концентрации в среде пероксида водорода0.00003–0.000035% наблюдается эффект, стимулирующий дополнительное свечение клеток. Придальнейшем увеличении концентрации эффективность свечения уменьшалась и становиласьниже контрольной. Полностью репрессировали люминесценцию концентрации пероксида 0.01%.В силусобственнойизлучательнойдетоксикацииклеткикультурымогутсохранятьжизнеспособность при концентрациях H2O2, токсичных для большинства других культур [231].Рост и свечение фотобактерий возможны в широком диапазоне температур и величин pH:от 10° до 35°C при pH исходном от 5.5 до 8.5.
При этом оптимумы для роста и наиболееинтенсивного свечения характерны для диапазона температур 15–27°C и области pH среды 7.0–7.5. Свечение клеток отсутствует, если бактерии культивируют при температуре вышеоптимальной на 15° или ниже на 10° и величинах pH ниже 5.0 или выше 9.0. Это объясняетсяразобщением системы переноса электронов на люциферазу, снижением скорости восстановленияNAD+ NAD+–зависимыми дегидрогеназами [299].Белки (сывороточный альбумин, лейкинферон) в инкубационной среде в концентрации до35% способны увеличить эффективность люминесценции. Характер свечения при этом меняется,становится двухфазным, с максимумом, соответствующим 20–25% концентрации белков, привремени инкубации не выше 25–30 мин.
В случае увеличения времени контакта и концентрациибелков кривая интенсивности свечения становится однофазной и затем эмиссия подавляется.164§ 14.2. Действие непрерывного и модулированного ультразвука на бактерииAliivibrio fischeriАнализ полученных данных свидетельствует о том, что пороги биологического действияУЗ, выражающегося в изменении (стимуляции) параметров, характеризующих метаболическиепроцессы (усиление биолюминесценции, ускорение роста) в клетках светящихся бактерийA. fischeri, значительно ниже порога УЗ разрушения их клеток в суспензии [237, 238].
Полагаем,что УЗ оказывает стимулирующее воздействие на изменение проницаемости клеточных мембранбактерий, усиливая транспорт ионов и метаболитов, в том числе ауторегулятора N(3’–оксогексаноил)–L–гомосеринлактона.Изменение уровня биолюминесценции после действия непрерывного УЗ интенсивностью0.4 Вт/см2 характеризовалось «колоколообразной» зависимостью (рисунок 54). Математическаямодель определена: Rational Function — y = (a+bx)/(1+cx+dx2) — для интенсивностей 0.2 Вт/см2и 0.4 Вт/см2, но с разными коэффициентами, которые отражали несколько более пологий видконтрольной кривой.
При увеличении экспозиции наблюдали дозозависимое тушениелюминесценции.I, отн.ед.а)б)35302520151050051015202530Время, чРисунок 54. а) влияние непрерывного УЗ 0.4 Вт/см2 на интенсивность свечения A. fischeri; б) математическаямодель.Методами математической статистически подтверждена объективность выявленноговлияния УЗ и H2O2 на увеличение эмиссии A. fischeri. При сравнении как роста, так и уменьшенияинтенсивности свечения с процентным содержанием пероксида водорода выявлена обратнаякорреляционная зависимость (r = –0.87; p < 0.05). Таким образом, вполне вероятно присутствиеактивных форм кислорода в среде после воздействия УЗ, что приводит вначале к росту, а затемспаду эмиссионной активности.
Метод дисперсионного двухфакторного анализа показал, что на165изменение эмиссионной активности оказывали влияние интенсивность и время обработки УЗ(р < 0.05).б)160160140140120120Свечение, %Свечение, %а)10080601008060404020200005010015057Частота модуляции, Гц91113Частота модуляции, Гц15Рисунок 55. Зависимость изменения интенсивности люминесценции A.
fischeri от частоты модуляции УЗ,в процентах от контрольного уровня, при интенсивности: а) 0.2 Вт/см2; б) 0.4 Вт/см2.Существенно стимулировала рост и интенсивность свечения (рисунок 55 б) клетокбактерий A. fischeri обработка УЗ с частотой модуляции 10 Гц; частичную утрату эмиссиирегистрировали в диапазоне частот 5–8 Гц; в области воздействия 3 Гц и более 20 Гц свеченияклеток не детектировали. Регуляция свечения, зависящая от плотности популяции клеток,происходит на уровне транскрипции. Клетки A.
fischeri синтезируют конститутивно и выделяютв среду пропорционально скорости роста и плотности бактерий небольшое количествоаутоиндуктора, или сигнального соединения — N(3’–оксогексаноил)–L–гомосеринлактона,который при накоплении и достижении пороговой концентрации — индуцирует эмиссию(эффект quorum–sensing) [187]. Аутоиндуктор легко проникает через мембрану клетоки связывается с рецептором — регулятором транскрипции Lux-R.
Последний активируетэкспрессию локуса luxGDABEGH. Аутоиндуктор, являясь представителем семейства сигнальныхмолекул, производных гомосеринлактона. Интенсификацию роста и повышение люминесценцииможно объяснить повышением проницаемости мембраны после УЗ воздействия (по даннымтеста с трипановым синим), потребления субстрата и активацией клеточного дыхания.Катализатором фотоэмиссии является цитоплазматический фермент люцифераза —монооксигеназа, осуществляющая сопряжённое окисление NADPH и длинноцепочечногоальдегида(R–CHO)молекулярнымкислородом.Такжев бактериальнуюсистемубиолюминесценции входит редуктаза жирных кислот. Выход катализатора может стимулироватьУЗ.Послечегов присутствииактивныхформкислородапроисходитинициация166экзотермической реакции, сопровождаемая люминесценцией в видимой средневолновой частиспектра.
Причём выделяющаяся свободная энергия расходуется на эмиссию, интенсивностькоторой напрямую зависит от концентрации АТФ и NADPH.Однако существует и противоположная точка зрения — алифатический альдегидв процесселюминесценциинеутилизируется.Л. Э. Алескерова,Е. Н. Ефременко,А. Д. Исмаилов и другие [231] исключали возможность образования альдегидного субстрата (R–CHO) для люциферазы путём восстановления соответствующих жирных кислот в NADPH–и АТФ–зависимой редуктазной реакции и окисления альдегида в монооксигеназной реакции.В этом случае УЗ, помимо изменения проницаемости мембраны, может действовать нафункционирование протонного и других клеточных насосов.Бактериальныеклеткипроявлялиспособностьк адаптацииприакустическомвоздействии. Так, облучение суспензии клеток (рисунок 55 а) УЗ интенсивностью 0.2 Вт/см2вдиапазоне частот модуляции от 10 Гц до 80 Гц практически не изменяло уровеньбиолюминесценции.
Более высокая модуляционная частота 85–100 Гц стимулировала эмиссию.Гашение свечения на 50% (и более) наблюдали при более высоких частотах 110–115 Гц.Вероятно, в таких условиях происходит разобщение системы переноса электронов налюциферазу [274]. Воздействие УЗ частотой модуляции 120 Гц разрушало клетки A. fischeri.Модуляция вблизи 1000 Гц также приводила сначала к резкому усилению свечения, а затемнаблюдали разрушение клеточной стенки и гибель микроорганизма. Математический закон,описывающий изменение оптической плотности культур, остался прежним (Rational Function),а эмиссионная активность фотобактерий менялась по уравнениям Hoerl Model при УЗинтенсивности 0.4 Вт/см2 и 4th Degree Polynomal (при интенсивности 0.2 Вт/см2), что отражалопохожий характерный колоколообразный вид всех полученных графиков.§ 14.3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
