Диссертация (1151313), страница 33
Текст из файла (страница 33)
При выборе оптимальных режимов акустического воздействия инсонировали«отработанные» лейкоциты с целью их повторного использования для продукции ИФН. Объёмобрабатываемой суспензии 8–10 мл содержал 6 × 106 кл/см3. Время воздействия варьировали от3 с до 300 с. Значение усреднённой по пространству интенсивности излучения УЗ составляло0.05–0.2 Вт/см2. Опытные и контрольные образцы помещали в колбы со средой для биосинтеза.Было выявлено, что режимы инициирующего интерфероногенез облучения во многомзависят от исходного состояния лейкоцитов и их активности.
Для клеток, однократноиспользованных при суспензионном биосинтезе («отработанных»), и лейкоцитов с низкойисходной активностью стимулирующими были интенсивности 0.05–0.4 Вт/см2 при времениэкспозиции от 30 с до 3 мин. На клетках крови разных видов животных были определены режимынаправленного акустического воздействия на отдельные виды клеток крови и на клеточныеструктуры: ЦПМ, ядра (глава 8 на странице 82; глава 9 на странице 101).
В связи с этим, с цельюстимуляции синтеза ИФН, был апробирован диапазон режима инсонации, способныйодновременно действовать направленно как на отдельные клетки в суспензии в целом, так и наЦПМ, в частности: интенсивность 0.05 Вт/см2, частота модуляции 800 Гц и время экспозиции15 с — 3 мин (таблицы 37 и 38).158Таблица 37. Влияние непрерывного УЗ на биосинтез ИФН при времени обработки 3 мин.ИнтенсивностьКонтроль0.050.10.20.40.7УЗ, Вт/см2Активность ИФН,15028002800280021002900МЕ, ± 501150Таблица 38.
Влияние времени воздействия амплитудно-модулированного УЗ интенсивностью 0.05 Вт/см2с частотой модуляции 800 Гц на выход ИФН.Время инсонации, сКонтроль153045607590Активность ИФН,150500210029002600700150МЕ, ± 50Такимобразом,установленрежимстимуляцииповторногосинтезаИФН«отработанными» клетками суспензии лейкоцитов, позволяющий значительно (в 20 раз)повысить выход ИФН.§ 12.1. Идентификация биохимическими методами полученногос использованием модулированного ультразвука интерферонаДляпроверкичистотыполученногоИФНи возможногоналичияв препаратеиммуноглобулина IgG использовали ELISA-тест.
Не было найдено присутствия примесейиммуноглобулинов в синтезированном препарате ИФН. Для дополнительного экспрессконтроля чистоты и отсутствия токсичности полученного лейкинферона в качестве тест-объектаприменялисветящиесябактерии,успешноиспользуемыев настоящеевремяв роличувствительных биосенсоров [89, 224]. Таблица 39 содержит диапазоны изменений значенияоптической плотности и эмиссионной активности A. fischeri после добавления в среду инкубациисинтезированного ИФН различной активности, внесённого на 50 мл суспензии.Таблица 39. Изменение базовой активности A. fischeri послевнесения лейкинферона.Активность интерферона, МЕ 125 250 1250 КонтрольОптическая плотность,21.95 1.92отн.
ед., ± 0.05Интенсивность свечения,21293621отн. ед., ± 1.0Тест показал, что ни одна из внесённых в питательную среду с бактериями концентрацийИФН не влияет разрушающе на клетки фотобактерий: опытные культуры отставали в скоростироста от контрольных очень незначительно, почти на уровне погрешности прибора. Более того,увеличение активности препарата ИФН интенсифицировало свечение по сравнению с контролем(p < 0.05), существенно не влияя на скорость роста. Эти результаты позволили сделать выводыоб отсутствии токсичности синтезированного и очищенного препарата лейкинферона.159Исходя из данных DS-Na-электрофореза с необходимыми маркерами, установленамолекулярная масса очищенного лейкинферона; она равна 20 500 Дальтон (рисунок 53).Рисунок 53.
Фрагмент электрофореграммы и денситограммы DS–Na–электрофореза в полиакриламидном гелечастично очищенного α-интерферона. ИФН — 1.2×102 МЕ, 2 мг белка. Окраска CBB R–250.Итак,в лабораторныхусловияхпослестимулирующегодействияамплитудно-модулированных УЗ волн интенсивностью 0.05 Вт/см2 при оптимальном режиме воздействия:частота модуляции 800 Гц, время экспозиции 30 с — 1 мин, бегущая волна, — был полученлейкоцитарныйинтерферон.Качествои степеньочисткисинтезированногометодомсуспензионного биосинтеза ИФН были оценены биохимически.Методы иммуноферментного анализа на твёрдом носителе (ELISA — тест) и SDSэлектрофореза в ПААГ позволили идентифицировать и установить молекулярную массуполученногои очищенногоИФН;онаравна20500Дальтон.Экспресс-тестс люминесцирующими бактериями подтвердил отсутствие токсичности синтезированногопрепарата (см.
§ 18.1. Влияние модулированного ультразвука на синтез интерферона настранице 261).16013. Изучение действия ультразвука на ткани лабораторныхживотных in vivo§ 13.1. Результаты воздействия модулированного ультразвука насперматозоиды мышей in vivoСеменники лабораторных мышей in vivo облучали со средней по пространству и времениинтенсивностью 1.0 Вт/см2 непрерывным и модулированным УЗ.
Остановимся выборочно нанекоторых частотах модуляции: 10 Гц, 250 Гц, 520 Гц, 1000 Гц от 30 с до 5 мин, несущая частота0.88 МГц (таблица 40).Таблица 40. Количество жизнеспособных клеток семенного эпителия в сечении канальца через 46 ч послевоздействия УЗ интенсивностью 1.0 Вт/см2 различной частотой модуляции в течение 5 мин (M ± m, p < 0.05)ЧастотаПокоящиеся первичныеПахитенныеСперматиды, % Сперматозоиды, %модуляциисперматоциты, %сперматоциты, %Контроль(98 ± 2)(97 ± 2)(97 ± 3)(98 ± 2)Непрерывный(87 ± 8)(84 ± 5)(93 ± 6)(87 ± 6)10 Гц(82 ± 4)(75 ± 8)(90 ± 5)(90.6 ± 1.0)250 Гц(97 ± 3)(97 ± 3)(99.0 ± 1.0)(99.0 ± 1.0)520 Гц(82.3 ± 1.9)(76 ± 3)(78 ± 2)(66 ± 2)1000 Гц(80 ± 6)(83 ± 3)(99 ± 1.0)(85 ± 7)Под действием выбранных частот значительного разрушения клеток семенного эпителияне наблюдали.
Процент жизнеспособных клеток не понижался ниже 65. При этом модуляционнаячастота 520 Гц оказывала небольшое супрессорное действие на развитие сперматозоидов, такженезначительно угнетала пахитенные сперматозоиды и сперматиды.Остальные применённые частоты модуляции, так же, как и воздействие непрерывным УЗ,не оказывали значительного отрицательного эффекта. Воздействие частотами модуляции 250и 1000 Гц приводило к небольшому увеличению относительного количества сперматиди сперматозоидов.§ 13.2. Действие ультразвука на лейкоциты кролика in vivoНа лабораторных кроликах (п.
3.5.1. Группы животных на странице 38), была проверенабезопасность амплитудно-модулированного УЗ для клеток крови in vivo. При определениистепени воздействия модулированного УЗ на клетки крови вначале с помощью тестас трипановым синим была определена жизнеспособность лейкоцитов после 30, 45 и 60секунднойинсонацииУЗинтенсивностью1.0 Вт/см2с частотоймодуляции10 Гц.Жизнеспособность в контроле была измерена в пяти пробах и во всех случаях меняласьнесущественно: 89.3%, 90.6%, 88.7%, 92.4%, 89.8%, что составило в среднем около 90 ± 2%.После инсонации в течение 30 с вновь проводили измерения жизнеспособности лейкоцитов161кролика сразу после обработки, далее спустя 1, 4 и 6 ч.
Минимальное значение составило 80,максимальное — 91%. Среднее результатов всех измерений незначительно отличалось отконтроля.45-секундная обработка краевой вены уха указанным режимом также не приводилак гибели лейкоцитов, жизнеспособность которых оставалась в пределах контрольных значений(от 88 до 90%) как сразу после воздействия, так и спустя 1–4 ч.60 с. Сразу после облучения — от 75.4 до 77.1%. Через час — от 72.8 до 74%; через 4 ч —83.6–85.1%, через 6 ч — 86.9–87.6%, через 8 ч — 88–90%.
В результате было выбрано времявоздействия 60 с, показавшее колебания жизнеспособности лейкоцитов.В таблице 41 приводятся результаты изменения абсолютного числа лейкоцитов в 1 млкрови после обработки амплитудно-модулированным УЗ крайних частот модуляции в течение60 с.Таблица 41. Количество лейкоцитов (×106/см3) в крови кролика после воздействиямодулированным УЗ интенсивностью 1.0 Вт/см2 в течение 60 с (M ± m, p < 0.05)Время после воздействия, чЧастотамодуляции Контроль014610 Гц100 Гц4.28 ± 0.0383.28 ± 0.033.09 ± 0.023.39 ± 0.044.26 ± 0.054.39 ± 0.103.20 ± 0.153.08 ± 0.153.47 ± 0.054.23 ± 0.104.47 ± 0.15Из приведённых данных видно, что сразу после воздействия число клеток уменьшалось,затем приближалось к уровню контроля и даже несколько его превосходило.§ 13.3. Действие ультразвука на живого возбудителя Dirofilaria repensСерия экспериментов доказала, что кратковременная (15–30 с) УЗ обработка кровиинвазированных собак никак не влияет на возбудителя (рисунки 26 а и б на странице 123).Увеличение терапевтической интенсивности УЗ от 0.05 Вт/см2 до максимально возможной —2.0 Вт/см2 — и времени экспозиции до 25 мин при полном спектре исследованных частотмодуляции 10–1000 Гц показало полное отсутствие какой-либо реакции со стороны D.
repens набегущую непрерывную и модулированную УЗ волну. Червь полностью сохранял активность,подвижность,жизнеспособность,целостностьи гиподермы), псевдоцели и внутренних органов.кожно-мускульногомешка(кутикулы162IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ14. Действие непрерывного и модулированного ультразвукана культуры микроорганизмовПри выборе микробных объектов работы были приняты во внимание таксономическиеразличия, своеобразие их физиологических характеристик и притягательные для исследователейсвойства. Культура Aliivibrio fischeri принадлежит к домену (царству) Eubacteria, культураHalobacterium halobium — к другому домену Archaea. Местообитание культур — среда с NaCl:в морях с 3% соли галотолерантной A. fischeri, среда с 25–30% NaCl экстремально галофильнойH.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
