Диссертация (1150814), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Коэффициенты поступательной диффузии определялись из наклонаэкспериментальных зависимостей дисперсии диффузионной границы 2 от времени эксперимента как:=∆ 22.12∆где 2 определяется как:2 =28((/))22. 2где – двоение шпатов, () – обратное значение интеграла вероятности, – максимальная ордината, – площадь под интерференционной кривой. Эксперименты были проведеныАлександром Губаревым, СПбГУ, физ.
факультет.ЯМР-спектрометрия: Поступательная диффузияКоэффициенты поступательной диффузии образцов поли (этиленимина) определяли стандартной двумерной диффузионной последовательностью Bruker (stebpgp1s) с использованием импульсов стимулированного эха и биполярного градиента. Время диффузии (Δ) составляло 50 ms,а длительность градиентного импульса ( × 0.5) составляла 2 . Полимеры растворяли в чистом дейтерированном метаноле без добавления соли 0.2 М .
Коэффициенты диффузиирассчитывали по внутренней программе Topspin для анализа релаксации и диффузии с исполь-- 25 зованием интенсивности сигнала групп 2 полимера в 1H-ЯМР-спектре при 2.78 ppm. Эксперименты были выполнены Анатолием Добродумовым, Институт высокомолекулярных соединений РАН, Санкт Петербург.ДенситометрияИзмерения плотности проводили в плотномере осцилляционного DMA 5000M (Anton Paar,Graz, Austria) в соответствии с процедурой Kratky et al..98 Удельный парциальный объем былвычислен из угла наклона зависимости плотности раствора от концентрации (1 − 0 ).Сканирующая Силовая МикроскопияПолиплексы изучались на подложках из слюды, на которые помещалось 10 μL исходного раствора.
Раствор выдерживали на слюде в течение 1 минуты, после чего раствор удаляли с помощью фильтровальной бумаги, а подложку помещали под вакуум до окончательного высушивания. SFM изображения были получены в полуконтактном режиме (tapping mode) на микроскопе Nanoscope IIIa Multimode system (Veeco,) используя кантилеверы полуконтактного типаNSC35 (μ-Mash, Estonia).Приготовление комплексов ДНК/ПЭИРазличные количества раствора PEI (с = 1 − 80 −1) пипетировали в раствор ДНК(с = 20 −1 ).
Расчет отношения / выполнялся согласно Boussif et al.99 Отношение массык заряду ДНК соответствует одному анионному заряду (Р) на 330 −1 , тогда как PEI имеетодин катионный заряд на 44 −1. В частности, для образования полиплексов при / = 1на 1 ДНК требовалось 0.13 ПЭИ. Полиплексы формировались в 0.05 М растворе NaCl прирН 7.4. После добавления раствора ПЭИ к раствору плазмиды, смесь перемешивали в течение10 секунд.
Затем, перед использованием, полиплексы инкубировались в течение 10 минут притой же температуре.Количественная Оценка Свободного ПЭИБыли исследованы растворы полиплексов с четырьмя различными отношениями /: 6.2, 11.6,28.6 и 57.8. Полиплексы были сформированы, в конечном объеме 3 mL, содержащем20 −1 ДНК. Полиплексы удаляли из дисперсии путем препаративного центрифугированияпри 20,000 в течение 2 часов.
После центрифугирования надосадочную часть раствора аккуратно собирали из центрифужного флакона. Концентрацию PEI определяли спектрофотомет-- 26 рически, после комплексообразования с 2+ , согласно Ungaro et al..100 Следуя этому методу,каждые 100 надосадочной части раствора смешивали с раствором ацетата меди(2 −1, Merck, Darmstadt, Germany) в прозрачном пластинчатом 96-луночным планшете(UV Star, Greiner Bio One, Frickenhausen, Germany) на длине волны 285 (Tecan Infinite M 200Pro, Tecan Group Ltd., Crailsheim, Germany). Количественную оценку концентрации полиэтиленимина, проводили по калибровочной кривой ПЭИ (5 − 200 −1 ), которую обрабатывалитак же, как и тестовые образцы.
УФ-спектрофотометрические измерения повторяли три раза, икаждый УФ эксперимент выполнялся дважды. В случае с высоким содержанием PEI в суспензии(/ 28.6 и 57.8) свободный PEI также определяли из эксперимента по скоростной седиментации с использованием интерференционной оптики (нижний предел определяемой концентрации ≈ 2 −1). Седиментация полиплексов наблюдалась при 1,000 rpm. После осажденияполиплексов центрифугу ускоряли до 40,000 rpm, что позволяло регистрировать низкомолекулярную компоненту, соответствующая PEI.Комплексообразование ДНК (Гель Электрофорез)Качественную информацию об образовании комплекса ДНК/PEI получали из экспериментов погоризонтальному электрофорезу. Поскольку для проведения экспериментов по связываниютребовалось большое количество ДНК, в качестве модели двухцепочечной ДНК, использовалиДНК “herring testes” (тип XIV, Sigma Aldrich, Deisenhofen, Germany).101-102 Полиплексы (отношение N/P от 0.5 до 30) были сформированы, как описано в предыдущем разделе, используя 5 ДНК (1 −1 ) и требуемое количество исходного раствора LPEI 0.9 −1.
Полученныесмеси разбавляли до общего объема 125 . После приготовления 5 загрузочного буфера(40 Tris, 50 % (v/v) глицерин 85 %, 1 mM EDTA, рН 7.4, Roth) смешивали с 50 аликвотамиразличных суспензий полиплексов, содержащих 1 ДНК herring testes. Затем образцы наносили на 1 % агарозный гель (peqGold Universal Agarose, Peqlab Biotechnology GmbH, Erlangen,Germany), содержащий этидий бромид (Sigma Aldrich). В качестве контрольного образца использовали свободный полимер и свободную ДНК. Электрофоретическое разделение проводили при 80 V камере для электрофореза (Biometra, Goettingen, Germany) с буферным белкомTAE (40 Tris, 1 % уксусная кислота, 1 mM EDTA, Roth) в течение 1 часа. Гели фотографировались с помощью гелевой системы фиксации (Digit Store UNO, Intas GmbH) под УФ-подсветкой(Intas GmbH, Гёттинген, Germany) при 312 nm.- 27 -Глава 3.
Результаты и Обсуждения3.1. Молекулярный и Структурный Анализ Катионных Полиэлектролитов3.1.1. Поли(2-аминоэтил-метакрилат) и Поли ((2-аминоэтил)-метакрилатсо-N-метил-(2-аминоэтил)-метакрилат-со-N,N-диметил-(2-аминоэтил)метакрилат)Создание и последующее исследование заряженных полимерных макромолекул представляют собой одну из наиболее перспективных областей органической и макромолекулярнойхимии.103 Отдельное внимания в данной области уделяется изучению полиэлектролитов: наличие заряженных фрагментов вдоль полимерной цепи приводит к очень специфическим и уникальным свойствам таких макромолекул по сравнению с их незаряженными аналогами.37-38Полиэлектролиты могут обладать, противомикробными, противоопухолевыми, противовоспалительными и антиоксидантными свойствами, наличие которых обуславливает их широкоеприменение в различных областях науки и промышленности.9, 104-108 Водорастворимые катионные полимеры, вследствие их способности образовывать полиэлектролитные комплексы сбиологически активными макромолекулами, в частности ДНК и РНК, могут быть использованыдля создания синтетических вирусов, а также для направленной доставки лекарственных препаратов в клетку.7, 26, 109-114 Идеальный генный комплекс должен быть нетоксичным, не испытывать деградации при 4 – 6, эффективно связывать/конденсировать молекулы ДНК/РНК вкомплекс, а также быть способным к высвобождению нуклеиновых кислот при “эндосомальном побеге”.
Эти свойства сильно зависят от общей химической структуры полимера и его исходных молекулярно-конформационных характеристик, в том числе термодинамической жесткости, способности к формированию водородных связей, гидрофобных взаимодействий, , атакже числа и типа аминогрупп среди прочих.115-122 Для дальнейшего понимания и развитияновых подходов к созданию функциональных комплексов, а также решения фундаментальныхзадач в области изучения полиэлектролитов, необходим направленный синтез новых заряженных полимерных макромолекул и их детальный молекулярно-конформационный анализ.
Многообещающими и привлекательными объектами для такого рода исследований являются сополимеры метакрилата, содержащие различные протонированные аминогруппы в боковых цепях.47, 123-126 Несмотря на значительные усилия и большой массив экспериментальных и теоретических наработок, определение абсолютных молекулярных и конформационных характеристик заряженных полимерных макромолекул, представляет собой очень насущную и нетриви-- 28 альную задачу. Наиболее часто применяемые подходы, применяемые при исследовании полимерных систем, подразумевают использование стандартных аналитических методик, такихкак: гель проникающая хроматография, различные виды масс спектрометрии (MALDI-TOFF, ESIMS), ядерно-магнитный резонанс.96, 127-128 Однако, в следствие “внутренних ограничений”, перечисленные методы анализа, могут лишь достаточно ограничено применимы для изучениясложных макромолекулярных систем, включая заряженные макромолекулы.Среди всеобъемлющего семейства разнообразных методов анализа, следует выделить классические гидродинамические подходы к изучению макромолекул (вискозиметрия, аналитическоеультрацентрифугирование, изотермическая диффузия, статическое и динамическое рассеяниесвета), которые прекрасно подходят для того, чтобы пролить свет на ключевые макромолекулярные характеристики полимерных макромолекул.Таким образом, в представленной работе, были исследованы гомологические ряды метакрилатов содержащие первичные, вторичные и третичные аминогруппы в боковых цепях: поли(2аминоэтил-метакрилат) (гомополимер) и поли ((2-аминоэтил)-метакрилат—со-N-метил-(2аминоэтил)-метакрилат-со-N,N-диметил-(2-аминоэтил)-метакрилат) (терполимер).129-130Рисунок 1.
Структурные химические формулы поли(2-аминоэтил-метакрилат)а (A) и поли((2-аминоэтил)-метакрилат—со-N-метил-(2-аминоэтил)-метакрилат-со-N,N-диметил-(2аминоэтил)-метакрилат)а (B).Полимеры были синтезированы методом RAFT полимеризации, химические структурысинтезированных макромолекул представлены на Рисунке 1. Как было отмечено выше, исходный анализ полимеров осуществлялся посредством стандартной эксклюзионной хроматографии, типичные распределения которой представлены на Рисунке 2. Данные по молярным мас-- 29 сам и дисперсности, полученные из хроматографических исследований, обобщены и представлены в Таблице 1.Рисунок 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
