Диссертация (1150360), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Структурные формулы использовавшихся в работепластификаторов.47Соотношение ПВХ:пластификатор составляло 1:2, то есть примерно 33 и66% массовых процента соответственно. Кроме этого в состав полимерноймембраны также входили ионообменные добавки, например, калия тетракис[3,5бис(трифторметил)фенил]борат,хлорированныйдиарболидкобальта,упрощающие перенос иона из анализируемого раствора в объем мембраны. Такжемембранысенсоровазотосодержащиесодержалилиганды,различныенапример,нейтральныедифосфинфосфоро-диоскидыиидиамиддигликолиевой кислоты.Твердотельные электроды представляли собой сенсоры с халькогениднымистеклянными мембранами, чувствительные к катионам различных тяжёлыхметаллов.
Они были приобретены у компании ООО «Сенсорные Системы»(Санкт-Петербург).Дляизготовленияиспользоваласьпластифицированныхстандартнаяметодика.Навескимембрандлясенсоровкомпонентовмембранысуммарной массой 300 мг в стеклянном стакане заливали небольшим объёмомсвежеперегнанного тетрагидрофурана (ТГФ) и перемешивали на магнитноймешалке до полного растворения. Изготовленная смесь переносилась втефлоновый бюкс, после чего оставлялась минимум на сутки до полногоиспарения ТГФ.
Из полученной мембраны вырезали диски требуемых размеров,которые затем вклеивали в корпуса электродов (ПВХ – трубки) при помощи клея,представляющего собой раствор ПВХ в циклогексаноне. После высыхания клеясенсоры заполняли 0.01 М раствором хлорида натрия и вымачивали одни суткиперед началом измерений в растворе того же состава. Между последующимиизмерениями сенсоры хранились на воздухе.Исследование электродных свойств мембран проводили методом измеренияэлектродвижущей силы (э.д.с.) гальванического элемента:Cu |Ag |AgCl, KClнас| исследуемый раствор |мембрана | 0,01М NaCl, AgCl | Ag |Cu48Электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод ЭСр 10103 (ООО«Измерительная техника», Москва), заполненный насыщенным растворомхлорида калия. Показания сенсоров снимали на 32-канальном цифровомвольтметре с высоким входным сопротивлением, подключенном к персональномукомпьютеру для сбора и обработки данных (рисунок 9).
Значения потенциаловбыли измерены с точностью 0,1 мВ.Рисунок 9. Потенциометрическая мультисенсорная система.Обработка полученных данных проводилась с помощью программногообеспечения «R version 2.13.0» (The R Foundation for Statistical Computing) и«Unscrambler 9.7» (CAMO, Norway).Проведение методики биотестирования на основе реакции Daphnia magnaне требовало использования специального оборудования.
Подсчет умершихособей дафний вёлся визуально с использованием простейшей лупы. Объёмисследуемой пробы составлял не менее 1 дм3, температура анализируемогообразца ~20С.Оценка хемотаксиса инфузорий Paramecium caudatum проводилась сиспользованием прибора «Биотестер-2» (рисунок 10), который позволяетопределять количество движущихся клеток.
Оптимальное число взвеси клетоксоставляло около 1000 в 1 мл пробы.49Рисунок 10. Биотестер-2.Прибор выдает информацию о средней концентрации находящихся вобъеме и движущихся клеток в условных единицах от 0 до 512. Существует тривозможных режима проведения эксперимента: 1) выдача одного отсчёта через 35секунд; 2) выдача среднего после 5 отсчетов; 3) выдача усредненного значенияпосле 10 отсчётов.Измеритель оптической плотности суспензии ИПС-03 (рисунок 11)применялся для исследования оптической плотности Chlorella vulgaris, котороепроводится непосредственно во флаконах, в которых культура выращивается.Рисунок 11.
Измеритель оптической плотности суспензии ИПС-03.Длина волны, при которой происходит измерение оптической плотности, 560±10 Нм. Диапазон измерения – 0,000 – 0,650, если оптическая плотность50культуры выше, чем представленное значение, то для получения корректныхрезультатов суспензию необходимо предварительно разбавить.Снижение люминесценции морских бактерий Vibrio fischeri измерялось спомощью специально разработанного для этих целей прибора «Microtox M500»(рисунок 12).Рисунок 12. Анализатор Microtox M500.Данныйприборпредставляетсобойинтеграциюлюминометраиинкубатора. Инкубатор способен одновременно поддерживать два температурныхрежима: 15°C – температура, при которой содержатся тестовые образцы, а такжеодна кювета с температурой 5°C, необходимой для хранения штамма бактерий врабочем режиме.
Люминометр измеряет количество света элиминированногоVibrio fischeri. Microtox подключен к персональному компьютеру для сбора ипоследующей обработки данных с помощью программного обеспеченияMicrotoxOmni (Carlsbad, CA, USA).Средства измеренияВесы электронные Ohaus Discovery, предел допускаемой погрешности±0,00001 г, класс точности (по ГОСТ) – 1.32-канальный вольтметр с высоким входным сопротивлением ХАН-11.51Вспомогательное оборудованиеМикродозаторы переменного объема фирмы «BIOHIT» вместимостью 0,1 –2,5; 2 – 20; 20 – 200; 200-1000 мм3 с пределом допускаемой погрешностиизмерения не более 5%.Мерный цилиндр (Химлаборприбор), 100 мл, предел допускаемойпогрешности ±0,15 мл, класс точности (по ГОСТ) – 2.Магнитная мешалка «IKA color squid» (Германия).Ячейка для потенциометрических измерений, 100 мл, тефлоновая.2.2.
РеагентыРеагенты для приготовления водных растворов поверхностно-активныхвеществ: додецилсульфат натрия («Невареактив», 98%), цетилтриметиламмонийбромид («Диа-М», 99%).Реагенты для приготовления водных растворов веществ класса фенолов:фенол («Вектон», 99,5%),о-нитрофенол («Невареактив», 99%), п-крезол(«ЛабТех», 99%).Вспомогательные реактивы: бидистиллированная вода.2.3. Исследуемые образцыВодные растворы индивидуальных токсикантов: поверхностно-активныхвеществ и соединений класса фенолов.Вкачествеиндивидуальныхтоксикантов,ккоторымизучаласьчувствительность массива сенсоров, были выбраны следующие вещества:поверхностно-активныевещества–додецилсульфатнатрия,цетилтриметиламмоний бромид, а также вещества, относящиеся к классу фенолов– фенол, о-нитрофенол, п-крезол.52В случае поверхностно-активных веществ диапазон концентраций водныхрастворов составлял от 10-6 до 10-2 моль/л для додецилсульфат натрия и от 10-6 до10-3 моль/л для цетилтриметиламмоний бромида.
Интервалы концентрацийиндивидуальных растворов ПАВ были выбраны исходя из литературных данныхо том, что 50% смертность дафний за 48 часов вызывали растворы, концентрациякоторых находилась в исследуемом диапазоне [105, 106].Растворы поверхностно-активных веществ были изготовлены весовымметодом, растворы с меньшими концентрациями приготавливались методомобъемного разбавления последовательно в 10, 100, 1000 и 10000 раз.
Все растворыбыли приготовлены на бидистиллированной воде непосредственно передпроведением эксперимента.Чувствительность массива сенсоров к веществам класса фенолов изучаласьв диапазоне концентраций: от 10-5 до 10-3 моль/л для фенола, от 10-5 до 10-2 моль/лдля о-нитрофенола и от 10-5 до 10-3 моль/л для п-крезола.
Интервалыконцентраций индивидуальных растворов этих веществ также были выбраныисходя из литературных данных о том, что 50% смертность дафний за 48 часоввызывали растворы, концентрация которых находилась в исследуемом диапазоне[107 – 109].Водные растворы фенола, о-нитрофенола и п-крезола были изготовленывесовым методом, растворы с меньшими концентрациями приготавливалисьметодом объемного разбавления последовательно в 10, 100, 1000 и 10000 раз.
Всерастворы были приготовлены на бидистиллированной воде.Водные растворы индивидуальных токсикантовДвадцать четыре водных раствора индивидуальных токсикантов былиизготовлены в Центре Исследований и Инноваций в Токсикологии ТехническогоУниверситета Каталонии (Террасса, Испания) (таблица 3). Объём каждогообразца составлял 500 мл, все растворы хранились в пластиковых бутылках сзавинчивающейсякрышкойвхолодильнике.Всеводныерастворы53индивидуальных токсикантов приготавливались непосредственно перед началомизмерений.Таблица 3.
Водные растворы индивидуальных токсикантовОбразецКонцентрацияПрименениеТоксичностьпроизводство4-нитроанилин32*10-5 моль/лкрасителей,умереннаяпестицидовкарбофуран3,8*10-4 моль/линсектицидвысокаяимидаклоприд1,6*10-3 моль/линсектицидумереннаясульфат ртути(HgSO4)диметилсульфоксиддихромат калия(K2Cr2O7)додецилсульфатнатрия2-хлорбензойнаякислота1,6*10-6 моль Hg/л2,9*10-3 моль/л3.6*10-4 моль/лхимическаяпромышленностьлекарственноесредствопроизводствокрасителейумереннаянизкаявысокая1,8*10-5 моль/лбытовая химиянизкая1,6*10-4 моль/лсинтез красителейумереннаяпроизводствофенол1,3*10-3 моль/лпестицидов,лекарственныхвысокаясредств3,4-дихлоранилин1,3*10-4 моль/лкофеин1,3*10-2 моль/лмочевина3,8*10-1 моль/лгербицидпищеваяпромышленностьминеральноеудобрениеумереннаяумереннаянизкая54ОбразецКонцентрацияПрименениеТоксичностьпищевая,лимонная кислота2,9*10-4 моль/лкосметическаянизкаяпромышленностьпроизводствотриэтиламин3,9*10-3 моль/лудобрений,высокаягербицидовпромежуточный4-хлорфенол3,1*10-2 моль/лпродукт присинтезеумереннаягербицидовуксусная кислота7,3*10-4 моль/лпищеваяпромышленностьпроизводствовысокая, прибольшихконцентрацияхα-нафтол1,1*10-4 моль/лацетонитрил2,2*10-3 моль/лборная кислота5,8*10-2 моль/линсектицидумереннаяэтанол2,5*10-3 моль/лбытовая химиянизкая3,5-дихлорфенол1,3*10-4 моль/лгербицидвысокая2-фенилэтанол2,9*10-4 моль/лцинковый купорос(ZnSO4·7H2O)глифосат2,9*10-5 моль/л1,8*10-4 моль/лпестицидовфармацевтическаяпромышленностьпарфюмернаяпромышленностьминеральноеудобрениегербицидумереннаяумереннаяумереннаяумереннаянизкаяРеальные водные образцыШестьдесят шесть образцов воды были предоставлены ЗАО «ЦИКВ», г.Санкт-Петербург и ФБУ "ЦЛАТИ по Северо-Западному ФО" и представляли55собой стоки различных промышленных объектов города Санкт-Петербурга, отборпроб осуществлялся по стандартным методикам (ГОСТ Р 51592-2000 «Вода.Общие требования к отбору проб», ГОСТ 17.1.5.04-81 «Охрана природы.Гидросфера.
Приборы и устройства для отбора, первичной обработки и храненияпроб природных вод. Общие технические условия»).Образцы были предоставлены в тщательно закрытых пластиковыхбутылках. Объём каждого образца составлял 450 мл, образец анализировалсянепосредственно в том виде, в котором он был получен [110].Двадцать шесть образцов были предоставлены Центром Исследований иИнноваций в Токсикологии Технического Университета Каталонии (Террасса,Испания) и представляли собой стоки различных промышленных объектовнескольких регионов Испании. Отбор проб проводился в соответствии состандартными методиками, принятыми в Испании. Объем каждого образцасоставлял 500 мл, все растворы хранились в пластиковых бутылках сзавинчивающейся крышкой в холодильнике.2.4.Оценка токсичности образцов с помощью методик биотестирования2.4.1.
Методика биотестирования с использованием Daphnia magnaЭтот метод основан на использовании дафний (Daphnia magna) – маленькихрачков (рисунок 13), в качестве индикатора острой токсичности водных объектов,т.е. токсичности, проявляющейся вследствие воздействия токсического вещества.Рисунок 13. Daphnia magna [111].56Обычно такой биотест выглядит следующим образом. Специальнуюкультуру Daphnia magna выращивают при постоянных условиях, таких кактемпература(20±2°C),освещение(рассеянныйсвет,отсутствиепрямыхсолнечных лучей), стабильное питание (суспензия водорослей) и отсутствиекаких-либо источников стресса. В возрасте четырёх дней отбирают несколько,обычно около десяти, особей и помещают их в устройство для тестирования, гдетакже поддерживается постоянная температура, освещение и кислородныйрежим,инаблюдаютчерезлупу,микроскопилиспомощьюкомпьютеризированной видеокамеры, за изменением двигательной активностидафний при помещении в камеру исследуемого образца воды.Присутствиевводетоксикантоввызываетсначалаповышеннуюдвигательную активность дафний, а затем угасание всякой активности и, привысокой токсичности, летальный исход.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
