Диссертация (1150360), страница 9

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 9)

В качестве живых особей рассматриваюттех дафний, которые свободно перемещаются в толще воды или всплывают наповерхность воды не позднее чем через 15 секунд после встряхивания сосуда,если этого не происходит, тест-объект считается умершим.Оценка токсичности химических веществ для Daphnia magna проводится спомощью установления средней (медиальная) концентрации – концентрациятоксического вещества, вызывающая гибель 50% тест-объекта за определённоевремя, в данном случае проводится 24-часовой опыт:Tгде Т – токсичность, а24ЛК 50124ЛК 50(6),– летальная концентрация вещества,вызывающая смерть половины живых организмов за 24 часа, мг/л.Однако обычно такой метод биотестирования проводится в течение 72 - 96часов. Если проводить наблюдения за поведением дафний, снижением ихвыживаемости и плодовитости более длительный период времени, то можноопределить хроническую токсичность воды. Образец воды определяется как57токсичный в том случае, если смертность особей превышает 20% или достоверноеснижение их плодовитости в тестируемой воде по сравнению с контрольнойпробой за период до 7 суток.Довольно широкий спектр веществ опасен и высокотоксичен для дафний:Cr2O72-, Cu2+, Cd2+, Hg2+, Cl-, пестициды различных типов, аммиак [4, 112].2.4.2.

Методика биотестирования с использованием Paramecium caudatumЭтот метод основан на способности инфузорий Paramecium caudatum(рисунок 14) перемещаться из неблагоприятных и опасных для их обитания зон вболее чистые.Рисунок 14. Paramecium caudatum.Количественной характеристикой степени воздействия загрязняющихвеществнатест-объектбудетсчитатьсячислоклетокинфузории,переместившихся вдоль градиента концентрации химических веществ, такоенаправленноеперемещениеназываютхемотаксис.Нужносказать,чтоперемещение этих живых существ может быть связано с различныминеблагоприятными условиями, различают гео-, магнито-, гальванотаксис, именнопоэтому так важно, чтобы в процессе биотестирования все остальные условия, заисключениемхимическогосоставасреды,оставалисьнеизменными.Достоинством инфузорий как биообъекта является крайняя чувствительностьорганизма к воздействию токсиканта, что предполагает быструю ответнуюреакцию на изменения состава окружающей водной среды.58Анализ, проводимый с участием инфузорий туфелек, выглядит следующимобразом: в фотометрическую кювету вносят взвесь клеток инфузорий, туда женаливают раствор поливинилового спирта, для увеличения плотности взвесиклеток инфузорий, и на плотный слой жидкости наслаивают исследуемыйобразец.

Если исследуемый образец нетоксичен, то практически все тест-объектыпереходят в этой слой; но чем выше токсичность пробы, тем меньше количествоклеток, которые оказываются в пробе.Как и в случае с дафниями, инфузории выращиваются в определённыхусловиях со строгим соблюдением качества и количества корма, температуры,значения pH, кислородного режима. Средой для культивирования является средаЛозина-Лозинского (состав – NaCl – 0,1 г/л, KCl – 0,01 г/л, MgSO4 – 0,01 г/л,CaCl2 – 0,01 г/л, NaHCO3 – 0,02 г/л), храниться она может около суток.В качестве тест-реакции используют показания специального прибора,который до начала эксперимента калибруют относительно разной концентрацииклеток инфузорий в миллилитре пробы.Степень токсического загрязнения оценивается с помощью индексатоксичности Т:TI k  I on(7),Ikгде Ik – величина тест-реакции для нетоксичной пробы, напримердистиллированной воды, Ion – величина тест-реакции для исследуемой пробы.Для инфузорий токсичными веществами являются тяжёлые металлы: Cd2+,Cu2+, Zn2+, Ni2+, хелатирующие соединения, пестициды [9, 113 - 115].2.4.3.

Методика биотестирования с использованием Chlorella vulgarisЭта методика предполагает использование в качестве тест-функции, котораяхарактеризует качество среды, изменение оптической плотности водорослихлорелла Chlorella vulgaris (рисунок 15), культивированной в чистой среде и висследуемой пробе, содержащей токсичные вещества.59Рисунок 15. Chlorella vulgaris [116].При анализе оценивают замедление роста водоросли, которое рассчитываютв процентах по следующей формуле:IXk  X0 100% (8)XkI – торможение роста водоросли, Xk и X0 – средние значения оптическойплотности соответственно в контрольной и исследуемой пробе.Водоросли этого вида культивируют в специальной питательной средеТамия (состав: КNО3 – 5.0 г/л; MgSO4*H2O – 2,5 г/л; KH2PO4 – 1,25 г/л), припостоянной аэрации в люминостатах или на специальных стеллажах, оснащённыхлампами дневного света.

Поддерживаемая температура составляет 18-20°C.Как и для дафний, и инфузорий, для хлорелл токсичными веществамиявляются тяжёлые металлы, а также гербициды, инсектициды [117].2.4.4. Методика биотестирования с использованием Vibrio fischeriИндикатором качества среды в этой методике обычно считают снижениеколичества света, производимого данным типом люминесцентных бактерийVibrio fischeri (рисунок 16).60Рисунок 16. Vibrio fischeri [118].Анализуменьшениялюминесценциипроводятнаспециальноразработанном для этого приборе и рассчитывают по формуле:I t0 C I 0  I tC0IGAMMA( Г )  0I tCгде Г – сокращение количества света,I 00 -(9),интенсивность свечения растворапри нулевой концентрации токсиканта в нулевой момент времени,I t0 -интенсивность свечения раствора при нулевой концентрации токсиканта в моментвремени t,I 0C -интенсивность свечения раствора при концентрации токсиканта C внулевой момент времени,I tC -интенсивность свечения раствора при концентрацииC токсиканта в момент времени t.

При последующей обработке полученнойинформации Г позволяет рассчитать эффективную концентрацию (ЭК) образца,при которой происходит снижение свечения на 50% за время t [119, 120]. Чемменьше значение ЭК50, тем токсичнее образец. Существуют несколько классовострой токсичности: «высокотоксичные» – ЭК501 мг/л; «токсичные» – ЭК5010 мг/л; «малотоксичные» – ЭК50  100 мг/л.Штамм морских бактерий выращивают вжидкой среде Луриа-Бертани(состав: пептон - 10 г, дрожжевой экстракт - 5 г, хлористый натрий - 10 г на 1 лраствора, при рН=7) в присутствии 3% NaCl.

В случае использования61агаризованной среды в этот состав добавлялся микробиологический агар,примерно, 20 г/л. Культивацию проводят при постоянной температуре 25°C [121].После выращивания бактерии хранятся в лиофилизированном состоянии,т.е. заморожены и высушены в вакууме, такой принцип содержания позволяетиспользовать особей в течение долго периода времени.Для морских бактерий опасными также являются тяжёлые металлы,гербициды, инсектициды, органические растворители.2.5.Исследование чувствительности индивидуальных сенсоров в водныхрастворах поверхностно-активных веществ и веществ, относящихся к классуфеноловОценивалась чувствительность 21 сенсора, которые предполагалосьиспользовать в дальнейшем эксперименте, к ряду поверхностно-активныхвеществ и нескольким веществам класса фенолов.

В массив входило 7 анион- и 9катион-чувствительных полимерных сенсоров, 5 твердотельных электродов наоснове халькогенидных стекол. Составы сенсоров соответствуют сенсорам,описанным в таблице 2.В массив сенсоров также был включен стеклянный pH-электрод.Изучение чувствительности сенсоров осуществлялось путем проведенияградуировочных измерений, в результате которых рассчитывались величиныуглового коэффициента (наклона) электродной функции всех сенсоров в растворекаждого из индивидуальных токсикантов.Измерения проводились в 50 мл ячейке, в которую помещалось 50 млраствора индивидуального токсиканта определенной концентрации, в первуюочередьисследовалсясамыйразбавленныйраствор,затемболееконцентрированные образцы.

Каждое измерение продолжалось три минуты(интервал снятия показания сенсоров – 7 секунд), после чего сенсорыополаскивались бидистиллированной водой, остатки влаги удалялись с помощью62фильтровальной бумаги. Для каждого из индивидуальных токсикантов былопроведено, по крайней мере, три калибровочных измерения.Послекаждогоанализамультисенсорнаясистемынесколькоразпромывалась в бидистиллированной воде, обычно такая процедура представляеттри отмывки по три минуты. Эта процедура промывки достаточна дляобеспечения воспроизводимости (СКО ≤ 3 мВ) показаний сенсоров в трехповторных измерениях.2.6.Исследование модельных водных растворов индивидуальныхтоксикантов и реальных водных образцов с помощью потенциометрическоймультисенсорной системыДля исследования водных образцов индивидуальных токсикантов иреальных водных образцов использовался массив сенсоров, состоящий из 21электрода.

В массив входило 7 анион- и 9 катион-чувствительных полимерныхсенсоров, 5 твердотельных электродов на основе халькогенидных стекол. Составысенсоров соответствуют сенсорам, описанным в таблице 2.Массив сенсоров, в который также был включен стеклянный pH-электрод,использовался для анализа образцов, отобранных в Санкт-Петербурге (66образцов), различных регионах Испании (26 образцов), а также 24 модельныхраствора индивидуальных токсикантов, изготовленных в Центре исследований иинноваций в токсикологии.Измерения проводились в 50 мл ячейке, в которую помещалось 50 млобразца или модельного раствора. Все растворы исследовались в том виде, вкотором они были получены; анализ образцов проводился не позже, чем через 6часовпослеотборапробы,дополнительныеразбавленияилиэтапыпробоподготовки не проводились (ПНД Ф Т 14.1:2:4.10-2004, ПНД Ф Т14.1:2:3:4.11-04 16.1:2.3:3.8-04, ПНД Ф Т 16.1:2.3:3.10-06, ФР.1.39.2007.03222).Каждое измерение продолжалось три минуты (интервал снятия показаниясенсоров – 7 секунд), после чего сенсоры ополаскивались бидистиллированной63водой, остатки влаги удалялись с помощью фильтровальной бумаги.

Для каждогоиз образцов было проведено, по крайней мере, три калибровочных измерения.После завершения измерения мультисенсорная системы несколько разпромывалась в бидистиллированной воде, проводилось три отмывки по триминуты.Этапроцедурапромывкидостаточнадляобеспечениявоспроизводимости (СКО ≤ 3 мВ) показаний сенсоров в трех повторныхизмерениях.2.7.

Применение хемометрических методов для обработки данных,полученных с помощью мультисенсорных систем2.7.1. Метод главных компонентМетод главных компонент (PCA - principal component analysis) – один изосновополагающих методов в хемометрике. Основной принцип этого методасостоит в разделении полученных данных на «содержательную» часть и «шум».Отклик массива сенсоров представляется в виде исходной матрицы данных, вкоторой n строк соответствует количеству исследованных образцов, а p столбцов– количество переменных, например, сенсоров в системе. Элементы матрицысоотносятся с откликом, полученным определенным сенсором в конкретномобразце.

Характеристики

Список файлов диссертации