Диссертация (1150173), страница 4
Текст из файла (страница 4)
При достижении ККА, образующиеся умолекулы ДНК мицеллоподобные агрегаты ПАВ не только нейтрализуют отрицательныйзаряд цепи ДНК, но и способствуют появлению эффективных сил притяжения междуразличными участками ДНК, что приводит к изменению ее конформации и17последующему сворачиванию в компактную структуру. В случае, когда концентрацияДНК в растворе достаточно велика, возможно протекание процесса конденсации споследующим выпадением комплексов ДНК/ПАВ в осадок.Процесс сворачивания индивидуальной молекулы ДНК под действием катионногоПАВ удалось проследить с помощью флюоресцентной микроскопии [84].
Было показано,что с добавлением ЦТАБ длинная геномная ДНК бактериофага T4 (166 тысяч пароснований) подвергается дискретному переходу от клубка к компактной глобуле. Взависимости от концентрации ЦТАБ молекулы ДНК в растворе присутствуют в трехразличных конформационных состояниях. При малой концентрации ЦТАБ все молекулыДНК находятся в виде развернутых клубков; при увеличении концентрации ЦТАБ донекоторого критического значения в растворе наблюдается появление глобул ДНК,сосуществующих с развернутыми молекулами.
Дальнейшее увеличение концентрацииПАВ приводит к сворачиванию всех молекул ДНК в глобулы. Полученные результатыбыли подтверждены с помощью динамического рассеяния света (ДРС) [103]. Применениединамического рассеяния света для исследования сосуществующих в объеме раствораклубков и глобул ДНК показало, что этот метод обладает рядом ощутимых преимуществпо сравнению с методом флюоресцентной микроскопии. В этом случае появляетсявозможность наблюдать цепи ДНК, невидимые в случае оптической микроскопии, атакже нет необходимости использовать флюоресцентные красители и антиоксиданты,вносящие искажения в точность оценки размеров исследуемых объектов.
В исследуемыхс помощью ДРС растворах концентрация ДНК мала, что позволяет исключить израссмотрения взаимодействие макромолекул друг с другом. В этом случае наблюдаемаяинтенсивность рассеяния оказывается малой величиной, а на графике распределениячастиц по размерам присутствует только один максимум порядка 330 нм,соответствующий молекулам ДНК в форме клубков. Для раствора чистого ЦTAБинтенсивность рассеяния мала и близка пределам погрешности прибора. Однако, придобавлении уже малых количеств ПАВ (≤ 2 μM) к раствору ДНК, в объемной фазеобразуются частицы с меньшим гидродинамическим радиусом (80 нм), чем для раствораДНК без добавок, что отражается в появлении второго максимума на соответствующемграфике.
С увеличением концентрации ПАВ этот максимум увеличивается, тогда какмаксимум, соответствующий молекулам ДНК в свободном состоянии, постепенноуменьшается и впоследствии полностью исчезает (≥ 30 μM ПАВ). Эти результаты18согласуются с раннее выдвинутым предположением об одновременном сосуществованиив растворе молекул ДНК в двух разных состояниях, а не о постепенном преобразованиивытянутой цепи в компактную глобулу. Было также установлено, что в определеннойобласти концентраций ПАВ обе образующиеся формы стабильны и сохраняются врастворе как минимум 10 часов. Однако, в области высоких концентраций ПАВобразовавшиеся глобулы ДНК способны агрегировать друг с другом и, в итоге,образовывать макроскопические агрегаты, выпадающие в осадок.Изотерма связывания для системы ДНК/ЦТАБ была получена в работе Мельниковаи др.
[110]. Показано, что участок S-образной изотермы, соответствующий резкомуувеличению степени связывания за счет кооперативных взаимодействий компонентов врастворе, совпадает с появлением в растворе клубков и глобул ДНК. С помощью методапотенциометрическоготитрованиябылаоцененастабильностьобразующихсякомплексов ДНК/ПАВ и установлен обратимый характер перехода “клубок – глобула”при добавлении в раствор полиакриловой кислоты.Конформация ДНК в присутствии катионного ПАВ в различных органическирастворителях исследовалась в работе [96].
Дискретный переход от клубков в глобулунаблюдался для всех исследуемых органических растворителей – спиртов, ацетона иэтиленгликоля.Построение фазовых диаграмм является стандартным подходом к систематическомуизучению взаимодействий между заряженными полиэлектролитами и ПАВ в объемнойфазе. К настоящему времени в литературе имеется обширная информация о фазовомповедении ДНК и бромидов алкилтриметиламмония с различной длиной углеводороднойцепи с добавками и без добавок соли [102].
Для всех исследованных растворовнаблюдалосьассоциативноефазовоеразделение,причемконцентрацияПАВ,необходимая для инициации фазового разделения, уменьшалась с увеличением степенигидрофобности ПАВ. Добавление соли приводит к смещению нижней границыдвухфазной области в сторону меньших концентраций ДНК.
С помощью методафлуоресцентной микроскопии было установлено, что концентрация ПАВ, необходимаядля начала процесса сворачивания ДНК в глобулу, возрастает с уменьшением длиныуглеводородного хвоста. Кроме того, область сосуществования в растворе клубков иглобул значительно сужается для ПАВ с большей длиной хвоста.При этом, еслиобратиться к изотерме связывания, полученной для данных систем, то в случае19использования ПАВ с большей длиной цепи увеличение степени связывания с ростомконцентрации ПАВ оказывается более резким, тогда как для более коротких молекулПАВ S – образный профиль сглаживается.Модуляция взаимодействий ДНК с ПАВ может также осуществляться за счетмодифицирования головной группы ПАВ [89,104,106,111]. Было показано, чтоархитектура и степень гидрофобности головной группы ПАВ оказывают значительноевлияние на процесс компактизации ДНК и его эффективность.Структура образующихся агрегатов ДНК/ПАВ также зависит от выбора ПАВ.
Былопоказано, что использование одноцепочечного ПАВ с относительно длиннымуглеводородным хвостом приводит к образованию агрегатов ДНК/ПАВ с гексагональнойструктурой [112,113]. В общем случае геометрическая форма образующихся в раствореагрегатов ДНК/ПАВ зависит от критического параметра упаковки = /0 ,связывающего между собой объем v и длину l углеводородного хвоста, а такжеэффективную площадь головной группы a0 ПАВ. В случае, когда Ns близок 1, ПАВобразует плоские бислои. Ионные ПАВ с относительно большой головной группой исредней длинной хвоста образуют структуры с большей кривизной поверхности. Так,структураагрегатовДНК/ЦТАБоказываетсягексагональнойисостоитизстержнеобразных мицелл ПАВ, окружающих молекулы ДНК [112]. Авторы такжепредположили, что ДНК в составе такого комплекса находится в А-форме.
Приуменьшении длины углеводородного хвоста ПАВ кривизна поверхности агрегатовувеличивается, в частности, за счет нарушения упорядоченности структуры. Поэтомуболее короткие ПАВ образуют агрегаты с ДНК, в которых отсутствет структура дальнегопорядка. Кроме того, недавно было показано, что между ДТАБ и короткими фрагментамиДНК возможно образование кубических структур [114]. В случае, когда происходитувеличение объема гидрофобной части, например, при использовании катанионныхсмесей ПАВ, образующиеся агрегаты имеют ламеларную структуру, где молекулы ДНКпредставляют двумерную фазу находящуюся между бислоями ПАВ [115,116].Возможность компактизации ДНК за счет образования комплексов-переносчиков спротивоположно заряженными агентами лежит в основе невирусной генной инженериии медицины.
По сравнению с вирусами, невирусные переносчики являются болеедешевыми, менее токсичными, не вызывают отторжения иммунной системой ипозволяют внедрение ДНК любой длины, тогда как вирусы способны вмещать лишь ДНК20с длинной не более 40000 пар оснований [117]. Однако, после попадания переносчикагенного материала внутрь клетки необходимо, чтобы комплекс был достаточноустойчивым к воздействию среды и, одновременно, не разрушался с преждевременнымвысвобождением ДНК. С другой стороны, степень компактизации ДНК в комплексе недолжна препятствовать разворачиванию ДНК при попадании в клеточное ядро. Напримере наиболее изученных на данный момент комплексов ДНК с катионнымилипосомами (липоплексов), было показано, что липиды, обеспечивающие наибольшуюкомпактизацию ДНК в комплексе, не являются наиболее эффективными [118]. Такимобразом, для успешной доставки ДНК в ядро клетки необходимо контролировать каккомпактизацию, так и декомпактизацию ДНК.
Выбор стратегии для декомпактизацииДНК зависит в первую очередь от типа химического вещества, использованного впроцессе компактизации.В случае использования катионного ПАВ декомпактизация может быть осуществленапутем добавления неионного [103] или анионного ПАВ [119,120], а такжециклодекстрина [45,121]. Неионные и анионные ПАВ образуют смешанные комплексы скатионным ПАВ, высвобождая молекулу ДНК в раствор.
При использовании анионныхПАВ разной длины было показано, что более гидрофобный ПАВ оказывается наиболееэффективным [120]. При добавлении к раствору комплексов ДНК/ПАВ неионных ПАВС12En, где n = 5, 8, 23, наиболее эффективным является ПАВ, имеющее наибольшуюголовную группу [103].Новый подход к осуществлению процесса декомпактизации был применен сиспользованием циклодекстрина [45,121]. Было показано, что и α- и β-формыциклодекстрина являются эффективными декомпактизизующими агентами [121].Однимизнаиболееинтересныхметодовконтроляпроцессакомпактизации/декомпактизации ДНК под действием ПАВ является применение рН- илисветочувствительныхПАВ[122,123].ОксиддодецилдиметиламинаявляетсярН-чувствительным ПАВ, существующим в протонированной или непротонированнойформе в зависимости от рН среды [122].
Таким образом, варьируя рН среды вустановленныхпределах,можноконтролироватьпроцессыкомпактизацииидекомпактизации ДНК. Использование светочувствительных ПАВ дает возможностьконтролировать процесс высвобождения ДНК из комплекса под действием видимого или21УФ света, провоцирующего появление в растворе более гидрофобного транс-изомера илиболее гидрофильного цис-изомера, соответственно [123].I.3.1. Полиэлектролиты и ПАВ на границе раствор - газПервые работы по поверхностным свойствам растворов противоположно заряженныхполиэлектролитов и ПАВ относятся к концу 1970-ых годов, когда в дополнение кдиаграммам растворимости Годдардом и др. было измерено поверхностное натяжениерастворов смесей нескольких технических полиэлектролитов с ДСН [124].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
