Диссертация (1150173), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Изотерма связывания полиэлектролита с ПАВ имеет обычноS – образный вид. При этом начало резкого увеличения степени связываниясоответствует ККА, а стремление этой величины к постоянному значению соответствуетпоявлению в объеме раствора свободных мицелл ПАВ [9,68].Фазовое поведение растворов полиэлектролит/ПАВ зависит от концентрацииполимера и его молекулярной массы, жесткости, степени разветвления и линейнойплотности заряда полимерной цепи, концентрации и длины углеводородного хвостаПАВ, а также добавок неорганической соли [6].I.2.2. ДНК в раствореПосле установления структуры ДНК и ее биологического значения числоисследований, направленных на изучение механизмов и процессов, протекающих внутриклетки, сильно возросло.
Понимание этих механизмов представляет первый этап на путик их контролированию и воспроизведению в искусственных условиях. Возможностьлечениязаболеваний,особеннонаследственных,путемвведенияновыхмодифицированных генов в клетки и ткани методом невирусной трансфекции привела когромному числу исследований в этой области [55,69]. Тем не менее, успешноеприменение новых технологий еще находится на начальной стадии, и необходимодальнейшее развитие как методов введения ДНК в ядро клетки, так и контроляпоследующего синтеза рибонуклеиновой кислоты (РНК) в клетке.В клетках живых организмов молекула ДНК присутствует в нативной B-форме с13правозакрученной двойной спиралью.
Двойная спираль ДНК способна разрушаться,например при повышении температуры, с частичным (плавление) или полным(денатурация) расхождением комплементарных цепей, которые сохраняют способность квосстановлению (ренатурации) при возвращении к исходным условиям [70]. В ходеденатурации происходит разрыв связей между азотистыми основаниями одиночныхцепей двойной спирали, что приводит к увеличению адсорбции УФ-излучения, ипроявлению гиперхромного эффекта. Таким образом, процесс денатурации можнонаблюдать по изменению оптической плотности при последовательном нагревании иохлаждении раствора ДНК. Температура, при которой половина цепей ДНКденатурировали, называется температурой плавления ДНК [71].Процесс разрушения двойной спирали, соответствующий конформационномупереходу “спираль – нить”, а также температура плавления ДНК зависят не только отпараметров среды – ионной силы раствора, рН, концентрации ДНК, но и от характеристиксамой молеклы ДНК – состава и порядка расположения оснований вдоль цепи.Изменение ионной силы раствора является наиболее распространенным способомстабилизации ДНК за счет экранирования электростатического отталкивания междусоседними фосфатными группами.
Увеличение концентрации соли приводит кповышению температуры плавления ДНК, которая, как было экспериментальноподтвержено, линейно зависит от логарифма концентрации соли, а угол наклона кривойпрактически не зависит от типа азотистых оснований, входящих в состав молекулыДНК [72].В работе Доти и др. было показано, что наличие большего количества пар снованийгуанин – цитозин (Г – Ц), соединенных тремя водородными связями, способствуетбольшей прочности молекулы ДНК и, соответственно, повышению температурыплавления и денатурации [73].
Позже авторам удалось получить зависимость,позволяющую определять тип и количественный состав азотистых оснований в цепи ДНКиз температуры плавления [74].Варьирование рН среды оказывает значительный эффект на конформацию ДНК врастворе. Температура плавления немонотонно зависит от рН среды, что связано сэффектами протонирования и депротонирования азотистых оснований в кислой ищелочной средах [75]. При рН<4.5 гуанин, цитозин и аденин протонированы, в результатечего происходит дестабилизация двойной спирали и, как следствие, понижение14температурыплавления.Вщелочнойсредетиминигуаниннаходятсявдепротонированном состоянии, что опять же препятствует формированию двойнойспирали и приводит к понижению температуры плавления ДНК.С помощью сканирующей микрокалориметрии безсолевых растворов ДНК былаполучена зависимость температуры плавления от концентрации ДНК, которая как и вслучае растворов с различной ионной силой, оказывается линейной фунцией логарифмаконцентрации ДНК [76].Персистентная длина двухцепочечной молекулы ДНК обычно составляет 50 нм, в товремя как та же характеристика для одноцепочечной ДНК варьируется от 0.75 до 8.5 нм,согласно различным источникам [77,78].
Тем не менее, очевидно, что одиночная цепьДНК оказывается значительно более гибким полиэлектрлитом. В то время как длинныедвухцепочечные молекулы ДНК в хорошем растворителе рассматриваются какполимерные клубки, короткие цепи длиной до нескольких сотен пар оснований,представляются жесткими стержнями, что имеет существенное значение привзаимодействии различиных по строению ДНК с другими компонентами в водномрастворе [79].В свободном состоянии молекулы ДНК представляют собой очень длинные цепи(102-104 мкм), намного превосходящие размеры клетки (0.1-1 мкм). При этом, в клеткахживых организмов ДНК находится в свернутом (компактном) виде, уменьшая объем,занимаемый молекулой, в десяткитысячраз.Установлено, чтодобавлениепротивоположно заряженных агентов в раствор ДНК позволяет воспроизвести процесссворачивания макромолекулы (переход от клубков к глобулам) в лабораторныхусловиях[45,80–84].
Образование компактных комплексов происходит за счетизменения электростатических взаимодействий как между сегментами полимерной цепиДНК, так и между полимерной цепью и растворителем, а также за счет изгибания илиискажения двойной спирали, гидрофобных взаимодействий или комбинации несколькихэффектов. В настоящий момент в литературе имеются данные о компактизации ДНК врастворе в присутствии многовалентных катионов металлов[45], липидов[44,85],поликатионов [45,86], наночастиц [46,87,88], катионных ПАВ [45,89–91] и ПАВ с двумяуглеводородными хвостами [92,93].Важно отметить, что термин “компактизация” используется в литературе как дляописания сворачивания индивидуальных молекул ДНК, так и процесса агрегации15нескольких молекул. В данной работе для обозначения конформационных превращенийодиночной молекулы ДНК используется термин “компактизация”, тогда как термин“конденсация” описывает объединение нескольких полимерных цепей.Возможные механизмы компактизации ДНК показаны на рис I.2.
Первый механизмсоответствует дискретному процессу сворачивания ДНК, в ходе которого приопределеннойконцентрациикомпактизирующегоагентаврастворевозможнососуществование как развернутых полимерных клубков, так и компактных глобул; приэтом образования промежуточных структур не происходит [45,86,94,95]. Такой типкомпактизации встречается в вирусах и некоторых бактериях, в которых уменьшениеразмеров молекулы ДНК происходит при участии многовалентных полиаминов [45,86].В лабораторных условиях подобного эффекта можно добиться при использовании“плохого” растворителя – этанола, или путем добавления неионных полимеров [96].Дискретный процесс перехода “клубок – глобула” близок к фазовому переходу первогопорядка между разупорядоченной газовой фазой (клубки) и конденсированной твердойфазой (глобулы).Рис. I.2.Схематичное изображение возможных путей компактизации ДНК in vivo.Второй тип компактизации ДНК соответствует непрерывному переходу отразвернутого полимерного клубка к компактной структуре.
Чаще всего это происходитпри возникновении сильных локальных сил притяжения между несколькими16последовательными нуклеотидными звеньями ДНК в присутствии поликатионов [97].Третий возможный механизм компактизации осуществляется засчет адсорбции ДНК наповерхности катионных наночастиц [87,88,98] или оборачивания ДНК вокруг другихнанообъектов, например, дендримеров [99]. Некоторыми авторами отмечаетсявозможность появления новых механизмов компактизации. Так, в работе Соллогуба и др.показано одновременное присутствие в объеме раствора глобул и “сморщенных” клубковДНК, что указывает на существование промежуточного типа между дискретной ипоследовательной компактизацией [100].
Отмечают также, что степень компактизацииили эффективность связывания ДНК в значительной степени зависят не только от зарядаи степени гидрофобности компактизирующего агента, но и от жесткости и длиныполимерной цепи ДНК [18,79].I.2.3. Взаимодействие ДНК и ПАВ в водном раствореВозможностьиспользованиякомплексовДНК/ПАВдлятехнологическихибиомедицинских целей вызвала интенсивное исследование взаимодействий ДНК и ПАВв водном растворе [43,84,101–106].
Комплексы между ДНК и противоположнозаряженными молекулами ПАВ используются при экстракции [107] и очистке ДНК [42],при изготовлении гибридных биоорганических высокоупорядоченных структур [108] иконструировании ДНК-чипов [109].Связывание молекул ДНК и катионных ПАВ происходит при концентрациях ПАВ,многоменьшихККМ.Изотермасвязываниявкоординатахстепеньсвязывания – концентрация свободного ПАВ имеет классическую S-образную форму,где участок резкого роста степени связывания соответствует началу кооперативноговзаимодействия компонентов в растворе [101]. Ассоциация ДНК и ПАВ, как и в случаедругих систем полиэлектролит/ПАВ, приводит к увеличению энтропии при замещениипротивоионов.Механизм связывания включает в себя несколько этапов. На начальном этапе, когдаконцентрация ПАВ в растворе мала, происходит присоединение мономеров ПАВ к ДНК,не оказывающее влияния на конформацию ДНК.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
