Диссертация (1145858), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Физиологические типы метанотрофов могут отражать условиякультивирования, таким образам детектируются только микроорганизмы, для которыхнаиболее благоприятны условия эксперимента (Amaral, 1995). Таким образом, использованиекультивируемых методов не полностью отражает истинный состав природных популяций.Оценка же физиологического состояния метан-окисляющего сообщества проводят поизменению потребления метана методами газовой хроматографии (Hanson, 1996).24Одним из эффективных методов для детекции метанотрофов и других бактерий в природныхобразцах является использование флуоресцентных антител, специфичным к мертвым клеткамв чистых культурах (Абрамочкина, 1987). Гальченко с соавт.
(1988) использовалиммунофлуоресцентный метод с антителами, специфичными к 14 штаммам метанотрофов,выделенных из природных источников, для идентификации и количественного анализаметанотрофного сообщества донных отложений Черного моря. При этом численностьметанотрофных бактерий была выше на 3 порядка, нежели при определинии численностипутем прямого культивирования.Также как и для метаногенов, некультивируемые формы метанотрофных бактерий могут бытьобнаружены методами молекулярного-генетического анализа. При этом олигонуклеотидныепробы для амплификации могут быть специфичны к участкам гена 16S рРНК (Wise, 1999),либо к последовательностям, кодирующим ключевые ферменты ответственные за процессыокисления метана.1.1.2.
Микробные ассоциации торфяных отложений, микроорганизмы, связанные сдеструкцией торфа.Несмотря на важность торфяных болот в процессах глобального цикла углерода и воды,состав микробных сообществ торфяных отложений изучен еще достаточно слабо. Основныеработы здесь посвящены изучению микробного разнообразия торфяных отложений болот наоснове анализа фрагментов гена 16S рРНК (Juottonen et al., 2005; Dedysh et al., 2006; Morales etal., 2006; Hartman et al., 2008; Ausecetal., 2009; Pankratov et al., 2011).На рис.
3 представлен обзор разнообразия состава микробных сообществ торфяных болот наоснове молекулярно-генетического анализа последовательностей генов 16S рРНК различныхгеографических регионов (Dedysh, 2011), и, в дополнение к этому, для сравнения приведеныданные о составе микроорганизмов тропических болот Тайланда (Kanokratana et al., 2011).Показано, что тропические и северные болота в целом имеют сходный состав основныхпаттернов микроорганизмов, которые, чаще всего включают в себя такие доминантные филы,как Acidobacteria и Proteobacteria.
Фила Acidobacteria в торфяных отложениях представленаподотделами 1, 3, 4, 8, из которых только подотдел 1 хорошо изучен с помощью методовкультивирования бактериальных изолятов, а подотделы 3 и 4 включают лишь несколькоописанных представителей. Протеобактерии, обнаруженные в торфяных отложениях чащевсегоклассифицируютсякакпредставителиAlpha-иDelta-классов,приэтомAlphaproteobacteria представлены в основном метанотрофами и метилотрофами из семействMethylocystaceae and Beijerinckiaceae (Dedysh et al., 2006; Dedysh, 2009). Из гетеротрофныхбактерий имеются сведения о представителях семейств Bradyrhizobiaceae, Acetobacteraceae,25Hyphomicrobiaceae и Caulobacteraceae, фототрофы представленыродами Rhodoblastus,Rhodomicrobium, и Rhodopseudomonas. Кроме того, для болот отличающихся повышеннымиуровнями сульфатов, показано присутствие в торфяных отложениях таких представителейDeltaproteobacteriaкакродаSyntrophobacter,Syntrophus,Smithella,GeobacterиAnaeromyxobacter (Morales et al., 2006).Рис.
3. Таксономическая характеристика микробных сообществ северных торфяных болотразличныхгеографическихрегионов.Длясравненияприведенсоставсообществмикроорганизмов тропических болот Тайланда (по Dedysh, 2011).Анализ расшифрованных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК библиотек клоновкислых сфагновых болот выявил менее крупные, но при этом довольно многочисленныефилы, такие как Verrucomicrobia, Actinobacteria, Planctomycetes.
Показано, что большинствопредставителей Verrucomicrobia относятся к таксономически не охарактеризованным группаммикроорганизмов, для которых культивирование на питательных средах не возможно.Представители Actinobacteria болотных экосистем к настоящему времени также остаютсяслабоизученными, в отличие от других представителей этой филы, населяющие почвы.Значительная часть расшифрованных нуклеотидных последовательностей фрагментов гена16S рРНК из образцов кислых торфяных отложений сфагновых болот принадлежали толькодвум характерным представителям этой филы: Acidimicrobium ferrooxidans и Ferrimicrobiumacidiphilum.
Еще один выявленный характерный представитель был классифицирован какConexibacter woesei, также уже устоявшийся член Actinobacteria (Dedysh, 2011).26Фила Planctomycetes - это одна из наиболее многочисленных бактериальных групп,выявляемых в библиотеках клонов с использованием таких широко распространенныхбактериальных праймеров, как 9-27f. В кислых сфагновых болотах представители филыотличаются широким разнообразием и представлены практически всеми известными кнастоящему времени основными линиями данной филы. Многие расшифрованные иотнесенные к филе Planctomicetes нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16SрРНК отличаются невысоким коэффициентом сходства (≤90%) к уже таксаномическиохарактеризованным микроорганизмом, к тому же, многие из них были отнесены к линиямнедавно описанных ацидофильных родов Schlesneria, Singulisphaera и Zavarzinella (Dedysh,2011).
Установлены и минорные группы микроорганизмов, отнесенные к Beta- иGammaproteobacteria: Chloroflexi, Bacteroidetes, Spirochaetes , Firmicutes, представленные восновном уже хорошо охарактеризованными группами микроорганизмов.Такимобразом,культивированиесиспользованиеммикроорганизмов,методов,большаянепредусматривающихчастьбактерийторфоввыделениекислыхиболотпредставлена не культивированными (некультивируемыми) представителями микробногосообщества с неизвестным метаболическим потенциалом.Обычно численность микробной популяции в типичном кислом сфагновом болоте колеблетсямежду 108-109 КОЕ на грамм сухого торфа (Williams и Crawford, 1983; Dedysh et al., 2001,2006; Kotsyurbenko et al., 2004), до 70% которых выявляется с помощью методовфлуоресцентной in situ гибридизации (FISH) c использованием универсальной бактериоспецифичной пробы EUB338, а около 10% выявлено с использованием архее-специфичныхпроб ARCH915 и ARC344.
Не выявленные с помощью специфической гибридизациибактерии, были обнаружены путем DAPI-окрашивания и имели очень мелкие размеры в длину(<0,5 мкм); их природа и метаболический статус остается не ясен (Dedysh, 2006).Только незначительная часть микробной популяции торфов может быть выявлена сиспользованием высева на стандартные агаризированные питательные среды (такие, какнапример питательный агар, среда R2A и др.), при этом количество колониеобразующихединиц варьирует в пределах 105 – 106 на г сырого торфа (Golovchenko et al., 2005; Dedysh etal., 2006), что составляет всего лишь 0,01-0,1% от общей бактериальной биомассы,выявленной при DAPI-окрашивании (Dedysh, 2011).
Большая часть таких бактериальныхизолятов, выделяемых на стандартных агаризованных средах, отнесены к Betaproteobacteria(Belova et al., 2006; Dedysh et al., 2006), в особенности к роду Burkholderia. Другая частьбактерий, также активно развивающаяся на поверхности твердых питательных сред,относиласькAlphaproteobacteria(такиеродакакBradyrhizobium,Mesorhizobium,Sphingomonas, Brevundimonas, Caulobacter, Hyphomicrobium), Actinobacteria (Mycobacterium,Rhodococcus, Streptomyces, Micromonospora), Gammaproteobacteria (Pseudomonas, Serratia,27Rahnella), Firmicutes (Paenibacillus, Bacillus) и Bacteroidetes (Pedobacter, Dyadobacter,Chryseobacterium). Анализ генов 16S рРНК показал, что данные бактериальные изоляты имеливысокую долю сходства (98 - 100%) с уже таксаномически описанными микроорганизмами.Наиболее широко используемые питательные среды обычно имеют нейтральный показательpH и концентрацию солей в пределах 1-3 г/л, что не соответствует истинным параметрамболотной воды (имеющей обычно показатель pH 3,5 - 5,5 и содержание солей 5 - 50 мг/л) иограничивает рост значительного числа представителей микробной популяции при выделениина таких средах.
Для более достоверного повторения состава болотной воды обычноиспользуют сильно разбавленные питательные среды с кислым показателем pH (4,0-5,0).Высокий потенциал данной стратегии использования сильно разбавленных кислых средпоказан при выделении новых представителей метаноокисляющих бактерий (Dedysh, 1998;Dedysh, 2009; Kip, et. al, 2011), а также метаногенных архей (Sizova et al., 2003; Brauer et al.,2006; Kotsyurbenko et al., 2007; Cadillo-Quiroz et al., 2009). Примером может служить успешноевыделение представителей Acidobacteria на средах с очень низким содержанием ионов иорганических субстратов: таких как MM, MM1, 10-кратно разбавленной R2A (Dedysh et al.,2006; Pankratov et al., 2008), которые к тому же не содержали в себе фосфатов, как былопоказано (Pankratov, 2010), обычно ингибирующих рост ацидобактерий.Большинство представителей микробной биоты, населяющей северные сфагновые болотаявляются психрофильными микроорганизмами с весьма низкой скоростью роста.
Колонииметанорофов, ацидобактерий и планктомицет обычно проявляются на поверхности твердыхпитательных сред на 4-8 неделях инкубирования (Dedysh et al., 2000; Pankratov et al., 2008;Kulichevskaya et al., 2009), а в случае ацидотолерантного факультативно-анаэробногоTelmatospirillum sibiriense продолжительность культивирования составила 5 месяцев (Sizova etal., 2007).Далее дадим обзор основных бактериальных доменов, представители которых обитают вторфяных отложениях сфагновых болот и освещены в научной литературе.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
