Диссертация (1145858), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Таксономически метаногены формируют пять порядков: Methanosarcinales (9 родов),Methanomicrobiales (8), Methanobacteriales (5), Methanococcales (4), Methanopyrales (1) (Booneand Castenholz, 2001). Большинство описанных видов способны продуцировать CH4 из H2 иCO2, а порядки Methanomicrobiales, Methanococcales и Methanopyrales содержат толькомикроорганизмы первой группы. Члены Methanobacteriales также относятся к первой группе,исключение составляет лишь род Methanosphaera. Другие метилотрофные метаногены и всеацетотрофы, относящиеся к Methanosarcinales, включая только известные облигатныеацетотрофы, формируют семейство Methanosaetaceae.
Порядок Methanosarcinales включаетметаболически разносторонние метаногены; несколько членов семейства Methanosarcinaceaeсодержит представителей всех трех вышеуказанных групп (Garcia et. al., 2000).Несмотрянаморфологическиобщийэнергетическийдивергентны.метаболизм,Например,метаногеныбольшинствофизиологическикультивируемыхиметаногеновоптимально растут в мезофильном интервале температур (Garcia et. al., 2000), нотемпературные рамки метаногенеза включает и психрофильные условия роста (1ºC) дляMethanogenum frigidum (Franzman et. al., 1997) и Methanosarcina lacustris (Simankova et.
al.,2001), и гипертермофильные условия (110ºС) для Methanopyrus kandleri (Kurr et. al., 1991).Несколько термофильных родов описаны для порядков Methanobacteriales и Methanococcales.Форма клеток также сильно варьирует даже внутри одного порядка, и ранжирована от кокков,палочек и спирилл до сарцин и плоских неправильных форм бактерий(Garcia et. Al., 2000). Каки у всех архей, клеточная стенка метаногенов состоит из пептидогликана, включающегопсевдомуреин, протеиновые субъединицы, или уникальный полимер – метанохондроитин(Kandler and Konig, 1998).Разнообразие мест обитания метаногенов отражает их физиологическую вариабельность, нообязательным фактором является наличие анаэробных условий. Местообитания метаногеноввключают (Garcia et.
al., 2000):-Анаэробные местообитания с разлагающейся органикой, которые включают в себяпостоянные или временно затопленныеводно-болотные угодья, болота, рисовые поля,соленые озера, пресноводные или морские отложения. Такие местообитания населены обычно16метаногенамипорядковMethanosarcinales,Methanomicrobiales,MethanobacterialesиMethanococcales.-Пищеварительный тракт различных организмов, включая жвачных животных, людей ичленистоногих,такихкактермиты.Анаэробныепростейшихтакжеимеютэндосимбиотических метаногенов.
Поскольку организм хозяина поглощает промежуточныесоединения, такие как ацетат, метаногены пищеварительного тракта преимущественногидрогенотрофны и часто представлены порядком Methanobacteriales.-Геотермальные условия, такие как горячие источники, нефтяные скважины игеотермальные жерла морского дна, где используемые субстраты (H2, CO2) поступают за счетгеологической активности.
Термофильные и гипертермофильные штаммы, выделенные изтаких местообитаний, относились к порядкам Methanobacteriales, Methanococcales иMethanopyrales.Болотныеэкосистемы,характеризуемыенакоплениемчастичнодеградированныхорганических веществ торфа (Laine, Vasander 1996) и низкой скоростью его разложения ванаэробных условиях, приводящей к значительным накоплениям углерода (Clymo, 1984),являются уникальными местообитаниями для метаногенов.Повышенный уровень воды в болотах экосистемах приводит к вертикальной стратификации снеглубоким аэробным верхним слоем и анаэробным (до нескольких метров) слоем торфа (рис.1). Выше уровня воды аэробные грибы и бактерии разлагают органические вещества до CO 2, вто время как ниже уровня воды, концентрация кислорода быстро падает с глубиной (Lloyd etal., 1998) создавая бескислородные условия разложения, осуществляемые ассоциациямианаэробных микроорганизмов.
Действуя во взаимосвязанных последовательностях, анаэробыпереводят органическое вещество в продукты брожения, в том числе органические кислоты,ацетат, и, наконец, в CH4 и CO2.17Рис. 1. Схематическое изображение циклов углерода и метана в болотах (Juottonen, 2008).Экология, физиология и систематика микроорганизмов, связанных с процессом метаногенеза,пока остаются мало охарактеризованными, особое значение здесь приобретает изучениемикробиологической активности, лежащей в основе метаногенеза, зависимость этихпроцессов от абиотических и биотических факторов. Метаногенные микробные в болотныхэкосистемах чрезвычайно сложны, а традиционные методы их изучения, основанные накультивировании микроорганизмов и выделении чистых культур оказались не достаточны дляописания огромного разнообразия микроорганизмов; такие методы часто оставляли безвнимания более 99% микроорганизмов, часто составляющих численно и функциональноважную часть микробного сообщества (Torsvik et al., 1990; Amann et al., 1995).
Применениеметодов молекулярной биологии, которые не зависимы от культивирования микроорганизмов,значительно улучшили результаты исследований и позволили раскрыть весь потенциалмикробных сообществ (DeLong, Pace, 2001); с начала их использования более 20 лет назадчисло детерминированных бактериальных фил возросло с 12 до более чем 50 (Hugenholtz etal., 1998; Rappe, Giovannoni, 2003), что позволило, к примеру, выделить широкое разнообразиемезофильных архей с неизвестными до селе функциями (Scheleper et al, 2005).Стандартные методы молекулярного анализа обычно начинаются с выделения бактериальнойДНК из природных образцов, затем проводят ПЦР-амплификацию маркерных генов,дифференциацию ампликонов методом молекулярного фингерпринтинга или клонирования и,18наконец, определяют состав микробной популяции путем секвенирования ДНК ифилогенетического анализа (Head et al., 1998; Bragina et al., 2012).
Одной из проблем в этойобласти исследований является связывание данных секвенирования с последовательностьюфункций микроорганизмов в болотных экосистемах (Gray, Head, 2001), а также в точном ивсеобъемлющем описании всего разнообразия микробных сообществ и их компонентов.Высокое разнообразие и численность прокариот создают условия для вычленения тольконаиболее доминантных компонентов таких сообществ, а распознавание того или иногокомпонента используя метод ПЦР во многом зависит от специфичности праймеров (Baker etal., 2003; Forney et al., 2004).Кроме того, основным недостатком метода ПЦР являетсяотсутствие относительности в амплификации, т.
е. концентрация амликона того или иноготаксона может не соответствовать реальному положению дел (Suzuki, Giovannoni, 1996).Метаногенные микробные сообщества могут быть охарактеризованы на основе анализафрагментов гена 16S рибосомальной РНК или гена метил-коэнзим М (mcrM), какмолекулярного маркера в широком природном разнообразии микроорганизмов. Природнымиусловиями для изучения стали многочисленные болота, почвы рисовых полей, вода, и морскиедонные отложения, гидротермальные источники, пищеварительный тракт животных,внутренние органы термитов, свалки и анаэробные реакторы (Chaban et al, 2006). Основнымиметодами, применяемыми для изучения состава метаногенных сообществ являются: анализбиблиотек клонов, денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ), температурныйградиентный гель-электрофорез (ТГГЭ), анализ полиморфизма однонитиевой ДНК (SSCP – отангл.
single strand conformation polymorphism), основанные на разделении фрагментов ДНКимеющих различные последовательности; а также метод T-RFLP (от англ. terminal restrictionfragment length polymorphism), основанный на различиях в длине рестрикционных фрагментову разных таксонов (Moyer et al, 1994).
В дополнение к этому применяют флуоресцентную insitu гибридизацию (FISH- от англ. fluorescens in situ hybridization) и мембраннуюгибридизацию (Raskin et al., 1994; Purdy et al., 2003), активность метаногенных сообществосуществляют путем анализа РНК, выделенной из природной среды (Lueders, Friedrich, 2002;Koizumi et al., 2004; Shigematsu et al., 2004).Изучение генов 16S рРНК может выявить филогенетическую принадлежность организма, ноне его функции в экосистеме. Множество функциональных групп, включая метаногенов, немонофилетичны по филогении 16S, что затрудняет их обнаружение и идентификацию,поэтому для анализа применяют 16S рРНК метаноген-специфичные праймеры (Marchesi et al.,2001; Wright, Pimm, 2003). Однако in silica анализ (Banning et al., 2005) показал, что данныепраймеры также амплифицировали и не-метаногенные Euarchaeota и Crenarchaeota.
Длярешения этой проблемы авторами были предложены три пары праймеров, которыеперекрывалиширокоеразнообразиенуклеотидныхпоследовательностей16SрРНК19метаногенов. Также была разработана серия праймеров для большинства Methanobacteriales,Methanosarcinales, Methanomicrobiales (Watanabe et al., 2004), кроме того, ряд группоспецифичных гибридизационных проб (Raskin et al., 1994) и праймеров для количественногоПЦР (Hori et al., 2006).Анализ маркерных генов, кодирующих функции, специфичные только для функциональнойгруппы метаногенов, позволяет решить проблему филогенетического расхождения. Кпримеру, метил-коэнзим-М-редуктаза (MCR, 2.8.4.1) – важнейший фермент, задействованныйв продукции CH4, катализирует финальную стадию метаногенеза (Deppenmeier, 2002).
Данныйфермент присутствует у всех хорошо-известных метаногенаов, отсутствует у не-метаногенныхArchaea и Bacteria (Chistoserdova et al., 1998; Thauer 1998; Bapteste et al., 2005) и состоит изтрех субъединиц –α, β, γ (Reeve et al., 1997). Ген, кодирующий α-субъединицу, mcrA, содержитконсервативную нуклеотидную последовательность и связан с каталитическими сайтами MCR(Hallam et al., 2003). Филогения mcrA повторяет филогению 16S рРНК, а идентификацияметаногенов основывается на анализе нуклеотидных последовательностей mcrA (Luton et al.2002).Основные результаты исследований, выполненные к настоящему времени с использованиемметодов накопительных культур, а также вышеуказанных методов молекулярной биологии,приведены в таблице 1 (Juottonen, 2008).
Представители порядков Methanosarcinales(семейства Methanosarcinaceae и Methanosaetaceae), Methanomicrobiales, Methanobacterialesявляются типичными обитателями торфяных отложений сфагновых болот.Первые исследования метаногенов с использованием молекулярного анализа выявили двеновые группы микроорганизмов: R10, отнесенная к Methanomicrobiales, и R17, отнесенная кMethanosarcinales (Hales et al., 1996), которые часто встречались в болотных экосистемах.Позже группа R10 также была описана для болот (Galand et al., 2002) на основе анализа mcrAгенов, на ряду с другой новой группой E2 (Cadillo-Quiroz et al., 2006), которые были отнесенык «болотному» кластеру, в то время как группа R17 составила «кластер рисовых полей»(Grosskopf et al., 1998).Состав метаногенных сообществ, как правило, меняется с увеличением глубины залеганияторфяных отложений (Galand et al., 2002; Cadillo-Quiroz et al., 2006) и кроме того, меняется взависимости от типа растительности, например между болотами с доминирующими Sphagnumили Eriophorum (Galand et al.
2003), с доминирующими Sphagnum и Carex (Rooney-Varga et al.,2007) или же с увеличением высоты над уровнем моря (Merila et al., 2006). В болотах Аляскиотмечена зависимость между составом метаногенных сообществ и изменениями pH итемпературы в течение вегетационного периода (Rooney-Varga et al., 2007).Методаминакопительных культур были изучены состав метаногенных сообществ (Sizova et al.
2003),изменения метаногенных сообществ в зависимости от pH (Kotsyurbenko et al., 2007) или20температуры (Hoj et al., 2008). Имеются данные о воздействии на состав сообществантропогенных факторов, таких, как например осушение болот (Laine, 1996).До недавнего времени считалось, что все представители групп метаногенов – нейтрофилы(Коцюрбенко, 2005), с оптимальным рН в области 6,5–7,5, не обладающие способностью кросту при значениях рН ниже 4,5. Позднее ряд бактериальных изолятов, выделенных из торфа,и отнесенных к Methanobacteriales, проявили свою активность при низких значениях pH(Williams, Crawford, 1985; Kotsyurbenko et al., 2007). Кроме того, новые штаммы бактерий,выделенные из североамериканских болот, были идентифицированы как представителиMethanomicrobiales (Brauer et al.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
