Диссертация (1145773), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Это хорошо коррелирует с данными, полученными на бермудской траве, у которойсодержание сахаров при действии Cd оказалось выше в чувствительном генотипе, где,видимо, в присутствии Cd тормозилась их утилизация (Xie et al., 2014). В этой работеподчеркивается,чторазличнаяCdустойчивостьможетопределятьсяразличнымадаптационным ответом, через различия в аккумуляции метаболитов - аминокислот,органических кислот и сахаров, которые в основном служат интермедиатами для осмолитов иантиоксидантов, участвующих в стрессовых реакциях и адаптациях к Cd стрессу.Исследование 72 час воздействия высоких концентраций Pb и Cd на метаболом корнеплодаредиса (Wang et al., 2015) позволил авторам установить, что в условиях Pb стресса наиболееглубокие перестройки происходили в углеводном и энергетическом метаболизме, тогда какCd обработка вызывала изменения преимуществннно в энергетическом и аминокислотномметаболизме.Работы,посвященныеисследованиюметаболическихоткликовнадействиестрессовых факторов в растениях амаранта, единичны.
В одной из них, выполненной нарастениях Amaranthus hypochondriacus, были изучены количественные изменения вдетектированных 18 полярных и 15 неполярных метаболитах привирусной инфекцииAgeratum enation. (Srivastava et al., 2012). Среди полярных проанализированы органические иаминокислоты и сахара, среди неполярных - жирные кислоты и стеролы. Показаноувеличение уровней фумаровой, яблочной, лимонной и рибоновой кислот, эритритола, миоинозитола, β-ситостерола, стигмастерола в листьях и стеблях индуцированных вирусомрастений, но снижение в них урацила, фенилаланина, аланина и ряда других метаболитов.Повышение уровней мио-инозитола и β-ситостерола в этих растениях приписываютстрессовому ответу, отмечая, что мио-инозитол является важным метаболитом и структурнойосновой ряда липидных сигнальных молекул, в том числе, участвующих в стрессовыхответах.
В отношении метаболитов, идентифицированных в стебле, важным явилось57установленноеавторамиснижениесодержаниярядаамнокислот(аланин,лизин,фенилаланин), а также глюкозы и сахарозы под влиянием инфекции, что связывают соснижением транспорта фотосинтетатов из листьев. С другой стороны, отмечается увеличениеконцентраций метаболитов цикла Кребса - цитрата и малата, что, по мнению авторов,указывает на усиление дыхательного метаболизма.Подводя итоги обзору литературных данных о характере влияния тяжелых металловна показатели роста и метаболизма растений, можно заключить, что вопрос о возможности ипутях участия органических кислот в механизмах устойчивости и адаптации растенийамаранта к действию кадмия и цинка остается недостаточно изученным и требуетспециального исследования.582. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫОбъектом нашего исследования явились растения амаранта двух видов - амарантахвостатого Amaranthus caudatus L., сорт Karwa dauta (Индия) и амаранта метельчатогоAmaranthus cruentus L., сорт Tampala (США), cемена которых были получены из отделаовощных культур ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Всероссийский институтгенетических ресурсов растений имени Н.И.Вавилова».Исследования выполняли на уровне целого растения в водной культуре сиспользованием питательного раствора Чеснокова следующего состава (г/л): Ca(NO3)2·4H2O 0,9; KNO3- 0,65; MgSO4·7H2O - 0,20; KH2PO4 - 0,25; NH4NO3 - 0,07.
Концентрации основныхионов в базовом питательном растворе при этом составляли (ммоль/л): NO3- - 14,93; K+- 8,27;Ca2+- 3,81; Mg2+- 0,81; SO42- - 0,81; H2PO42- - 1,83; NH4+ - 0,87. Микроэлементы и железовносили в растворы согласно Хогланда в концентрациях (мкмоль/л): Fe-90; Mn-7; Zn-0,7; Cu0,8; Мо-0,008, B-0,46 (Чесноков и др., 1960).При постановке опыта семена амаранта в течение 20 минут стерилизовали в 3%растворе H2O2, промывали 3 раза в дистиллированной воде и проращивали в контейнерах спрокаленным кварцевым песком при световом режиме 16 ч свет (24 ± 1°C) / 8 ч темнота (18 ±1°C) и относительной влажности 70–75%.Проростки поливали питательным раствором, разбавленным в 10 раз, затем в возрасте7 суток их переводили на полив питательным раствором, разбавленным в 5 раз, далее втечение 7 суток их поливали раствором, разбавленным в 2 раза.
В возрасте 3-х недельрастения переводили на полив полным питательным раствором, в возрасте 4-х недель ихпересаживали в водную культуру в сосуды объемом 3л, заполненные полным питательнымраствором. Каждый вариант опыта включал 3 сосуда, по 3 растения на сосуд. Растворы всосудах постоянно аэрировали с помощью подсоединеных микрокомпрессоров и обновляликаждые 7 суток. Величину рН растворов контролировали ежедневно и поддерживали науровне 5,8 ±0,1. Исключение составили опыты, где рН растворов задавали и поддерживали науровне4,5±0,2 или 6,8±0,2. Выращивание опытных растений проводили в световойустановке под лампами ДРЛ-400 при освещенности 3500 люкс с поддержанием следующихусловий: 16 ч свет (24oC±1°C) / 8 ч темнота (18oC±1°C); относительная влажность 70-75%.Освещенность на уровне верхнего листа составляла 250 мкмоль фотонов ·м-2 ·сек-1.Опыты по воздействию Cd и Zn выполняли на растениях, достигших 6-недельноговозраста. При постановке опыта питательные растворы обновляли и вносили в них соли59кадмия или цинка согласно схеме опыта.
В качестве источника Cd использовали 3CdSO48H2O, в качестве источника Zn - ZnSO4·7H2O. Концентрации вносимого в растворы Cdсоставили 0 (контроль), 30 и 90 мкМ, концентрации Zn - 0, 100 и 300 мкМ,продолжительность экспериментов с воздействием Cd и Zn -7 суток. В экспериментах сэкзогенным внесением органических кислот их вносили в растворы в форме Na солей вконцентрации 2,5 ммоль/л. Все опыты выполняли в 3-кратной повторности.АБРис.7. Общий вид растений A.caudatus (A) и A.cruentus (Б) при съеме опыта.По окончании эксперимента проводили съем опыта.
Растения разделяли на органы корни, стебли и листья. В опытах, выполненных на растенияях A.caudatus, листья нижнегояруса (зрелые) и листья верхнего яруса (молодые или ювенильные, собранные вверхушечную розетку) учитывали раздельно. Корни в течение 5 мин отмывалипоследовательно в 0,1 мМ растворе CaCl2 и в дистиллированной воде для удаления Cd и Zn,адсорбированных на их поверхности. Сырую биомассу органов оценивали традиционнымгравиметрическим методом.
Далее растительный материал фиксировали при 105°С в течение1 часа и высушивали при 70°С в течение 24 часов до абсолютно сухого веса.Для выполнения анализа содержания Cd, Zn и минеральных элементов (K, Ca и Mg)сухой растительный материал измельчали до порошкообразного состояния, отобранныепробы озоляли смесью концентрированных азотной и хлорной кислот в объемном отношенииHNO3: HClO4= 4:1 при 160oC. Анализы выполняли в Образовательном ресурсном центре понаправлению химия СПбГУ. Содержание кадмия и цинка в полученных пробах определялина атомно-абсорбционном спектрометре AA-7000 (“SHIMADZU”, Япония). Содержание60калия, кальция и магния определяли на оптическом эмиссионном спектрометре синдуктивно-связанной плазмой ICPE-9000 (“SHIMADZU”, Япония).Определение локализации Cd в корнях и стеблях растений амаранта, подвергнутых 7суточному экспонированиювприсутствии90мкМCd,проводилиспомощьюгистохимического метода анализа с применением металлохромного индикатора дитизона(Серегин и др., 2004).
Срезы выполняли с помощью микротома Leica. Исследованиепроводили с помощью светового микроскопа Leica DM 4500p (Leica, Германия, 2007) вРесурсном Центре "Хромас" СПбГУ.Определение локализация Zn в органах растений амаранта выполняли методомэлектронной микроскопии на сканирующем электронном микроскопе - микроанализатореTM3000 (Hitachi, Япония),оснащенном приставкой энергодисперсионного микроанализаOXFORD, с использованием программы SwiftED300, что позволило получить картыраспределения химических элементов при сканировании выбранной зоныповерхностирастительного образца.
Обнаружение кристаллов оксалата Ca, Cd и Zn в листьях амарантавыполняли методом электронной микроскопии на сканирующем электронном микроскопе микроанализаторе TM3000 (Hitachi, Япония). Оба исследования проводили в РесурсномЦентре микроскопии и микроанализа СПбГУ. Схема подготовки проб и анализа в нихкристаллов оксалата была следующей:Пробы листьев амарантаВодный экстракт (удаление водорастворимых форм) + водонерастворимая фракцияЦентрифугирование водонерастворимой фракции при 15000gОтбор нижней фракции (белый осадок)Промывание осадка водой и фильтрование через фильтры Шотта с диаметром пор 100µmПолучение кристалловРастворение кристаллов 1N HCl и анализ на ГХ-МСАнализ кристаллов под микроскопом61Анализ фазового состава кристаллов оксалата кадмия и оксалата кальция в листьях икорнях растений амаранта проводили рентгенодифракционным методом в Ресурсном Центре«Рентгенодифракционные методы исследования» СПбГУ на дифрактометре Bruker «D2Phaser».Содержание водо- и кислоторастворимой форм щавелевой кислоты определяли всухом материале путем экстракции щавелевой кислоты, соответственно, водой или 1N HCl(1:100) и титрования оксалатов в кислой среде с использованием метода перманганатометриив соответствии с ранее описанным (Осмоловская и др., 2007).Анализ состава и определение концентраций метаболитов проводили в сухомматериале с использованием метода газовой хромато-масс-спектрометрии (ГХ-МС).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
