Диссертация (1145773), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Работапроводилась на газовом хроматографе Agilent 6850GC с масс-селективным детектором 5975С(США) и на газовом хромато масс-спектрометре GCMS-QP2010 Plus фирмы SHIMADZU.Подготовка проб для анализа на ГХ-МС включала экстракцию и дериватизацию и состояла изследующих этапов:1.Растительный материал в порошкообразном состоянии (50мг) ресуспендировали в 800мкл метанола и хранили в холодильнике в течение 1 суток.2.Пробы перемешивали в течение 30 секунд и центрифугировали при 15 тыс.
об/мин втечение 10 минут. Супернатанты в количестве 500 мкл переносили в чистые флаконы.3.Метанольные экстракты метаболитов (супернатанты) высушивали в вакуумномротационном испарителе Eppendorf Concentrator Plus (“Eppendorf”, Германия) в течение 2 час.4.Высущенные экстракты растворяли в 30 мкл метоксиамин гидрохлорида в пиридине,добавили 55мкл MSTFA (N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) и встряхивали при37°С в течение 30 мин.5.1 мкл реакционной смеси использовали для инжекции в газовый хроматограф.
Анализтриметилсилильных производных проводили с помощью газового хроматографа Agilent6850 GC и GCMS-QP2010 Plus.При работе на Agilent 6850GC использовали колонку HP-5MS, 30м х 0,25 мм. Толщинаплёнки неподвижной фазы 0,25 мм. Газ-носитель - гелий, скорость потока - 1,3 мл/мин, присбросе 1:20. Хроматографирование велось в режиме постоянного потока воздуха черезколонку.Температураиспарителя320°C.Анализпроводилсяприлинейномпрограммировании температуры от 70 до 320°C со скоростью 4°C/мин. Кислоты62анализировали в виде силильных производных.
Сбор данных осуществлялся с помощьюпрограммного обеспечения Agilent ChemStation. Обработка и интерпретация массспектрометрической информации проводилась с использованием программы AMDIS(http://www.admis.net/index.html) и стандартных библиотек масс-спектров NIST2005 и Wiley6.Количественнаястандартизацииинтерпретацияпохроматограммуглеводороду С19иС23проводиласьметодомспрограммыпомощьювнутреннейUniChrom(http://www.unichrom.com/unichrome.shtml). Хроматографические параметры представлялисьв шкале арифметических индексов удерживания.При работе на GCMS-QP2010 Plus использовали разделительную капиллярнуюколонку ZebronTM ZB-5MS (5% Phenyl-Arylene 95% Dimethylpolysiloxane, длина 30 м,внутренний диаметр 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм), Phenomenex.
Газ-носитель - гелий,скорость потока -0.97 мл/мин. Объем пробы - 1 мкл, режим ввода пробы - Splitless (безделения потока), время ввода - 60 с. Программа изменения температуры термостата колонки начальная температура 70°C, линейное повышение температуры (5°C/мин) до 300°C,поддержание (10 мин) температуры 300°C. Основные характеристики масс-спектрометра:ионизация электронным ударом (EI), температура ионного источника -200°C,энергиядвижущихся электронов - 70 эВ, режим регистрации полного ионного тока - 0.34 c /сканирование, диапазон m/z значений - 50 - 550. Для количественного определенияметаболитов проводилась калибровка с использованием внешних стандартов и матриц сдобавкой стандартов.Статистическую обработку полученных данных выполняли методом главныхкомпонент в программе Microsoft Excel 2010 c использованием программы Statistical analysistool on Microsoft Excel (RIKEN Plant Science Center (Japan).
МГК позволяет отобразитьмногомерные данные на 2-х мерной поверхности, сделав их доступными для восприятия.Данные метаболомного анализа обрабатывались с использованием алгебраической модели,основанной на следующем уравнении:, гдеХ – матрица предобработанных (нормированных и центрованных) метаболомных данныхразмерностью IxJ, каждая строка (I) – наблюдение/образец и каждый столбец (J) –параметр/метаболит; T – матрица счетов (координат в новом пространстве) размерностью63IxA; P- матрица нагрузок (коэффициентов метаболитов) размерностью JxA; E – матрицаостатков/ошибок; A-число рассчитываемых главных компонент; t – главные компоненты, рпараметры главных компонент.Анализ метаболитных профилей и построение теплокарт метаболитов был выполнен сиспользованиемметодовмультивариоционнойстатистикиспомощьюпрограммыMetaboAnalyst на сайте www.metaboanalyst.ca.Все данные получены в 3-х биологических и 3-х аналитических повторностях.
Втаблицах и на рисунках приведены средние арифметические трех биологическихповторностей и их стандартные отклонения. Достоверность различий между среднимизначениями оценивали с учетом t-критерия Стьюдента при р ≤ 0.05 и/или р ≤ 0.01.643. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ3.1 Исследование влияния Cd и Zn на основные физиолого-биохимическиепоказатели растений Amaranthus cruentus и Amarnthus caudatus и их устойчивостьк действию металлов3.1.1.
Влияние Cd и Zn на накопление биомассы и аккумуляцию кадмия и цинкав органах амарантаВ наших экспериментах основным биометрическим показателем устойчивостирастений к действию стрессора был выбран прирост биомассы. Оценка показателей весабиомассы растений в контрольном варианте свидетельствовала, что растения A.caudatusотличаются более высокими темпами роста по сравнению с A.cruentus. По окончании 7 сутэкспонирования на растворе с внесением Cd в концентрации 90 мкМ у обоих видов амарантанаблюдалось отставание в росте от контроля. При этом вес сырой биомассы надземныхорганов у A.caudatus оказался ниже контроля в среднем на 35% в условиях как Cd, так и Znвоздействия, тогда как у A.cruentus накопление сырой биомассы затормозилось на 45-55% кконтролю.
Еще сильнее (на 63%) под воздействием Cd у A.cruentus нгибировался приростсырой биомассы корней, в то время как у A.caudatus отставание составило в среднем 28%(Рисунок 8). Аналогичная закономерность отмечалась и в отношении действияZn.Результаты оценки веса сухой биомассы растений свидетельствовали, что торможение ееприроста у A.caudatus было незначительным и фактически отмечалось только на уровнелистьев, составив 18% при действии Cd и 10% - при действии Zn, в то время как различий ввесесухой биомассы стебля и корней относительно соответствующих контролей ненаблюдалось (Рисунок 9).
В растениях A.cruentus степень ингибирования прироста сухоговещества относительно контрольных значений была существенновыше и составила всреднем 38% в листьях и 45-47% в корнях. Тот факт, что внесение Cd и Zn в среду сильнееповлияло на прирост сырой, чем сухой биомассы, по-видимому, можно объяснить потерейтургора и нарушениями водного обмена растений, что ранее отмечалось другими авторамипри изучении стрессового действия тяжелых металлов (Vassilev et al., 1998a; Poschenrieder,Barcelo, 1999).
При этом достоверных различий между эффектом Cd в концентрации 90 мкМи Zn в концентрации 300 мкМ установлено не было. В то же время полученные данные даютоснование предполагать, что растения вида A.caudatus обладают большей устойчивостью кдействию Zn и Cd, чем растения A.cruentus.65Рис. 8. Влияние Cd и Zn на накопление сырой биомассы растений амаранта (* p<0,05,**p<0,01)Рис.
9. Влияние Cd и Zn**p<0,01)на накопление сухой биомассы растений амаранта (* p<0,05,Анализ содержания Cd и Zn в корнях и надземных органах амаранта позволилустановить, что в ходе эксперимента оба металла интенсивно поступали в опытные растенияи в наибольших концентрациях накапливались на уровне корней (Рисунок 10). Согласнополученным данным, аккумуляция Cd в корнях A.cruentus составила 2710 мгк/г сухойбиомассы, что оказалось на 36% выше, чем в корнях A.caudatus, однако перенос этогометалла в надземные органы был, напротив, более интенсивным у A.caudatus.
При этомконцентрация Cd в листьях A.caudatus составила 90,6 мкг/г, в то время как в листьях66A.cruentus она не превысила 27,0 мкг/г (Рисунок 9). В итоге, градиенты концентраций Cd всистеме корень-лист достигли соответственно 22 и 100 раз у A.caudatus и у A.cruentus.Цинк в отличие от кадмия, несколько интенсивнее аккумулировался в корняхA.caudatus, где его концентрация достигла 4953 мкг/г в сравнении с 4695 мкг/г у A.cruentus,однако перемещение Zn в побег происходило в целом более активно у A.cruentus (Рисунок10). Особенно высокий уровень Zn в побеге наблюдался в стеблях A.cruentus, где он составил1358 мкг/г против 568 мкг/г у A.caudatus, тогда как в листьях концентрация Zn оказаласьвыше у A.caudatus (385 мкг/г против 215 мкг/г у A.cruentus).
Градиенты концентраций Zn,зафиксированные для системы корень-лист, у обоих видов были ниже отмеченных для Cd, исоставили 12,9 для A.caudatus и 21,8 для A.cruentus. Из полученных данных также следовало,что при заданных концентрациях Zn (300мкМ) и Cd (90мкМ) в среде аккумуляция цинкаккумулировался в корнях A.caudatus в 2,5 раза, а в листьях - в 4,2 раза интенсивнее кадмия.Рис. 10. Содержание кадмия и цинка в корнях и надземных органах растений A.caudatus иA.cruentus при экспонировании на питательном растворе с внесением 90 мкМ Cd и 300 мкМZn.3.1.2. Влияние кадмия и цинка на содержание минеральных элементов в органахамаранта.В литературе имеются противоречивые сведения о влиянии тяжелых металлов напроцессы минерального питания и формирование элементого состава растений.
В этой связис целью изучения характера воздействия кадмия и цинка на показатели минерального обмена67у растений амаранта нами было проведено сравнительное исследование влияния указанныхметаллов на концентрации K, Ca, Mg в корнях и надземных органах растений A.caudatus иA.cruentus. Данные, полученные в результате проведенного исследования, свидетельствовали,что у обоих видов амаранта в элементном составе как корней, так и надземных органов,доминировал калий.
Концентрации калия в листьях A. caudatus и A.cruentus в контролесоставили в среднем 198 и 261 мг-экв/100 г сухой биомассы, в стеблях они достигалимаксимальных значений 291 и 288 мг-экв/100г, а в корнях были близки к уровням,зафиксированным в листьях (Рисунки 11, 12, 13). Уровни аккумуляции кальция в листьяхисследованных видов амаранта оказались ниже концентраций калия в среднем в 1,5-1,6 раза,а концентрации магния - в 2,4 и в 4,2 раза ниже калия у A. caudatus и A.cruentusсоответственно (Рисунок 11). Сходный порядок убывания концентраций этих элементов(K>Ca>Mg) наблюдался и в корнях, однако содержание в них Ca и Mg оказалось заметнониже, чем в листьях (Рисунок 13).Было установлено, что внесение Zn и особенно Cd в питательную среду существенноснижало концентрации всех исследованных макроэлементов как в корнях, так и в листьяхA.cruentus, тогда как у A.
caudatus негативное воздействие металлов проявлялось намногослабее (Рисунки 11-13) Особенно сильный эффект был отмечен в корнях A.cruentus вотношении калия, содержание которого в расчете на единицу веса сухой биомассы снизилосьв присутствия Zn и Cd в 2 и в 2,2 раза относительно контроля (Рисунок 13), в то время как влистьях снижение концентрации этого элемента составило 1,3 и 1,5 раза (Рисунок 11). Врастениях A. caudatus влияние Cd и Zn проявилось в основном в отношении аккумуляциимагния, концентрация которого достоверно снижалась в корнях, стеблях и листьях, тогда какуровень кальция в них практически не менялся при воздействии тяжелых металлов.Негативный эффект Cd и Zn.
наблюдался у A. caudatus и в отношении поступления калия,при этом в наибольшей степени (в среднем на 30%) содержание К снижалось в стеблях(Рисунок 12), тогда как в корнях и листьях снижение аккумуляции калия в сухой биомассе непревышало 16-18% (Рисунок 11 и 13).68Рис. 11. Влияние кадмия и цинка на содержание макроэлементов в листьях A.caudatus иA.cruentus (* p<0,05, **p<0,01)Рис.
12. Влияние кадмия и цинка на содержание макроэлементов в стеблях A.caudatus иA.cruentus (* p<0,05, **p<0,01)69Рис. 13. Влияние кадмия и цинка на содержание макроэлементов в корнях A.caudatus иA.cruentus (* p<0,05, **p<0,01)Как было отмечено ранее, ионный состав листьев растений, в том числе, амарантаизменяется в ходе онтогенезе листа (Осмоловская и др., 2007). Поскольку у растенийA.caudatus и A.cruentus в возрасте 5-6-недель формировался верхний ярус молодых(ювенильных) листьев, в рамках нашего исследования оценка воздействия Cd на показателиэлементного состава листьев была проведена также раздельно для зрелых и ювенильныхлистьев A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
