Автореферат (1145715), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1, «А»).При сравнении 2,5-ДМП и классического стрессора – иммобилизации было показано,что 2-часовая иммобилизация повышает частоту НМ через 22 часа после завершениявоздействия, причем сила эффекта не отличается от 2-часового действия 2,5-ДМП (рис. 1,«В»).Ана-телофазный тест на хромосомные аберрации, который использовали в даннойработе, выявляет макронарушения хромосом: мосты, фрагменты, множественныеперестройки (рис. 1.).
Причины их возникновения могут быть различны, например,слипание теломер,недорепликация в S-фазе, неправильная репарация одно- идвунитевых разрывов (Aguilera, Garcia-Muse, 2013).7Рис. 1. Частота нарушений митоза (M ± SE, %) в клетках КМ самцов мышей CBA (А),BALB/c (Б) и C3H (В) при различной продолжительности воздействия 2,5-ДМП ииммобилизации.
«К» – контроль, «ДМП4ч», «ДМП24ч», «ДМП48ч» – воздействие2,5-ДМП в течение 4, 24 и 48 часов, соответственно; «ДМП2ч+22ч», «ИММ2ч+22ч» –2-часовое воздействие 2,5-ДМП или иммобилизации при фиксации материала через 22часа после завершения воздействия. В экспериментах было использовано 24 (А), 12 (Б) и18 (В) самцов. Различия между группами: «*» – p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001,ANOVA.
Под графиками изображено нормальное деление «Норм» и типичные нарушениямитоза: «ФР» – одиночный фрагмент, «М» – одиночный мост, «Мн П» - множественныеперестройки. Масштабная линейка в углу фотографий – 10 мкм.Для дальнейшего изучения генотоксического эффекта 2,5-ДМП было изучено еговлияние на индукцию микроповреждений ДНК (одно- и двунитевые разрывы, апуриновыеи апиримидиновые сайты) в клетках КМ самцов CBA методом щелочного кометногоэлектрофореза.
Было показано, что 2- и 4-часовое воздействие приводило к увеличениючастоты поврежденных клеток в 2,3 и 1,9 раза, соответственно (рис. 2, «А»). Увеличениечастоты сильно поврежденных клеток наблюдали только при 2-часовом воздействии (рис.2. «Б»). При этом генотоксический эффект 2,5-ДМП был значительно слабее инъекцииакриламида, который является сильным химическим мутагеном (рис. 2.).Генотоксический эффект был также показан для ещё одного классического стрессорамыши – хемосигналов мочи домашней кошки. При этом обнаруженный генотоксическийэффект был сравним с эффектом воздействия 2,5-ДМП. При 2-часовом предоставлениихемосигналов мочи кошки происходило увеличение микроповреждений ДНК: общейчастоты поврежденных клеток и частоты сильно поврежденных клеток в 1,7 и 4,3 раза,соответственно (критерий ANOVA, p<0,05).При этом 24-часовое предоставление запаха мочи кошек, как и в случае с 24-часовымвоздействием 2,5-ДМП, не приводило к увеличению доли клеток с микроповреждениямиДНК, однако приводило к увлечению частоты клеток с хромосомными нарушениями вмитозе в 1,6 раза (t-критерий, p<0,01).8Рис.
2. Средняя частота поврежденных ядер клеток КМ (M ± SE, %), с содержанием >5% ДНК в хвосте кометы (А) и сильно поврежденных ядер клеток с содержаниемДНК в хвосте кометы >20% (Б), у самцов линии СВА после воздействий различнойдлительности. Варианты воздействия: «К» – контроль; «ДМП-1, 2, 4, 24» – воздействие2,5-ДМП в течение 1 часа, 2 часов, 4 часов и 24 часов, соответственно; «АКР» – инъекцияакриламида. В эксперименте было использовано 50 самцов. Различия между группами: «*»– p<0,05; «**» – p<0,01; «***» – p<0,001, ANOVA.
Под графиками изображены примерывнешнего вида комет у мышей из контрольной группы «К», мышей после двухчасовоговоздействия 2,5-ДМП «ДМП 2ч» и после инъекции акриламида «АКР».Таким образом, на данном этапе работы было показано, что воздействие 2,5-ДМПприводит к дестабилизации генома в клетках КМ самцов мышей различных линий,выявляемой как методом щелочного кометного электрофореза (уже через 2 часа посленачала воздействия), так и ана-телофазным методом учета хромосомных аберраций (ужечерез 8 часов после начала воздействия, при пиковых значениях через 24 часа). Крометого, было показано, что два классических стрессора мышей (воздействие мочой кошки ииммобилизация), также как и 2,5-ДМП, приводят к быстрой дестабилизации генома клетокКМ у мышей, что выражается как в повышении уровня микроповреждений ДНК, так и вувеличении частоты НМ.2. Определение гормонального ответа на 2,5-ДМП и хемосигналы самок-одиночек(ХСО). Следующим этапом данной работы было изучение механизмов, посредствомкоторых ольфакторные воздействия могут привести к дестабилизации генома клеток КМсамцов мышей.
Для данной цели был изучен гормональный ответ на действие 2,5-ДМП:были исследованы изменения концентрации гормонов стресса (кортикостерона), а такжелютеинизирующего гормона (ЛГ), тестостерона и окситоцина.В эксперименте использовали дополнительное воздействие хемосигналами самок,рассаженных поодиночке (ХСО), почти не содержащими 2,5-ДМП (Novotny et al., 1986).9Эффект 2,5-ДМП сравнивали с эффектом ХСО, для того чтобы оценить специфичностьгормонального ответа именно на эту молекулу, в отличие от ответа на хемосигналы самокв целом.Выбор кортикостерона был обусловлен тем, что он является главным эффекторнымгормоном оси гипоталамус-гипофиз-надпочечники (ГГН), и повышение его концентрацииявляется свидетельством развития организменного стресса.
Выбор других гормонов былобусловлен тем, что 2,5-ДМП является исключительно хемосигналом самок (Novotny et al.,1986; Andreolini et al., 1987), и можно было предположить, что он будет оказыватьполоспецифичные эффекты на самцов.В результате было установлено, что при 30-минутном воздействии 2,5-ДМПпроисходило достоверное повышение уровня кортикостерона более чем в 25 раз, посравнению с контролем, при этом через 60 минут воздействия концентрациякортикостерона опускалась до контрольных значений (рис. 3, «А»). Данные результатывпервые однозначно продемонстрировали, что при предоставлении 2,5-ДМП развиваетсястресс-реакция. При этом было обнаружено, что ещё одним эффектом действия 2,5-ДМПбыло снижение концентрации окситоцина в 2,6 раза при 60-минутном (но не 30-минутном)воздействии (рис.
3, «Б»). Известно, что окситоцин активирует антиоксидантную защитуклеток (Szeto et al., 2008), препятствует выделению АКТГ и глюкокортикоидов (Hartwig,1989) и может рассматриваться как анти-стресс гормон (Uvnas, 1998).Одновременное воздействие 2,5-ДМП и ХСО (как и воздействие только ХСО) неприводило к изменению концентрации кортикостерона и окситоцина, по сравнению сконтролем, что может говорить о том, что ХСО может нейтрализовывать эффект 2,5-ДМП(рис. 26, «А, Б»).При этом ни одно из воздействий не повлияло на концентрацию ЛГ и тестостерона.Рис.
3. Изменение концентрации кортикостерона (А) и окситоцина (Б) в плазме кровисамцов мышей линии СВА при запаховом воздействии 2,5-ДМП «ДМП»,хемосигналов самок-одиночек «ХСО», совместном действии этих хемосигналов«ДМП+ХСО» в течение 30 или 60 минут, а также – при контрольном воздействиидистиллированной водой «H2O».
Использована шкала десятичного логарифма. Награфиках указана медианная концентрация и межквартильный диапазон. Уровеньзначимости различий указан над линиями, критерий Краскела-Уоллиса. В экспериментебыло использовано 58 самцов.103. Роль стресс-гормонов в формировании генотоксических эффектов стресса.Посколькубылопоказано,что2,5-ДМПиндуцируетстресс-реакциюусамцов-реципиентов, на следующем этапе работы была изучена роль двух основных типовстресс-гормонов: глюкокортикоидов (кортикостерона) и катехоламинов – в дестабилизациигенома при 2-часовом действии 2,5-ДМП или иммобилизации.В качестве блокатора оси ГГН был выбран метирапон, который широко применяют висследованиях для подавления синтеза глюкокортикоидов (Young et al., 2007; Filaretova etal., 2012).
В качестве фармакологического блокатора действия катехоламинов был выбранβ-адреноблокатор - пропранолол, который блокирует действие адреналина и норадреналиначерез β-адренорецепторы всех типов. Ранее было показано, что пропранолол можетблокировать повреждения ДНК, вызванные хроническим иммобилизационным стрессом(Hara et al., 2013). Анализ повреждений ДНК проводили ана-телофазным методом.Воздействие метирапоном приводило к достоверному снижению частоты НМ,вызванных как 2,5-ДМП, так и иммобилизацией (до контрольного уровня) (рис. 4.).Воздействие пропранололом также приводило к достоверному снижению частоты НМ,вызванных иммобилизацией (до контрольного уровня) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
