Автореферат (1145715), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Более того, дестабилизация генома является одним из основных механизмовстарения организма. Таким образом, данные, полученные в нашей работе, могут внестивклад в понимание развития ряда заболеваний, а также – в биологию старения.4Другим важным результатом данной работы было выявление способности нервнойсистемы стабилизировать геном периферийных клеток у нестрессированных,стрессированных и подвергнутых действию физического мутагена (радиационномуоблучению) животных. Этот эффект особенно важен в свете трансляционного потенциаларезультатов работы в сферу клинической медицины, поскольку он демонстрируетвозможность самого организма стабилизировать геном собственных соматических клеток,не только при физиологическом стрессе, но и в случае воздействия физическимимутагенами.Положения, выносимые на защиту.Психосоциальные стрессоры (хемосигналы 2,5-диметилпиразин, моча кошек, а такжеиммобилизация) могут индуцировать состояния нервной системы, приводящие кдестабилизации генома клеток костного мозга самцов мышей.Дестабилизация генома клеток костного мозга при действии 2,5-диметилпиразинаассоциирована с увеличением концентрации кортикостерона и снижением концентрацииокситоцина в плазме периферической крови самцов мышей.Эффект дестабилизации геномаклеток костного мозга при действии2,5-диметилпиразина, а также иммобилизации может быть полностью или частичнонейтрализован применением фармакологических блокаторов стресс-гормонов.Изменение стабильности генома клеток костного мозга при действии ольфакторныххемосигналов полностью опосредовано обонятельным эпителием носовой полости иассоциировано с модуляцией активности нейронов главных обонятельных луковиц самцовмышей.Социально-значимые хемосигналы самок-одиночек могут подавлять развитиеольфакторно индуцированного стресса и стабилизировать геном клеток костного мозга какинтактных, так и облученных в дозе 4 Гр самцов мышей.Методология и методы диссертационного исследования.
В работе был использованкомплексный подход, включающий в себя неинвазивные способы различныхпсихо-социальных воздействий на мышей разных линий. Для анализа стресс-реакции наразных уровнях применяли современные методы, такие как функциональнаямагнитно-резонансная томография, иммуноферментный метод определения концентрацийгормонов в крови, кометный электрофорез единичных клеток, ана-телофазный методанализа хромосомных аберраций. Во всех экспериментах материал шифровали,использовали не только негативный, но, по возможности, и позитивный контроль,применяли адекватные методы статистической обработки данных.Личный вклад автора.
Основная часть экспериментальной работы, планированияэкспериментов, описания исследований, анализа и обсуждения результатов выполненаавтором самостоятельно. Измерения концентрации гормонов методом ИФА и изучениеактивации различных зон мозга методом фМРТ были выполнены совместно ссотрудниками Центра коллективного пользования «SPF-виварий» Института цитологии игенетики СО РАН, что нашло отражение в совместных публикациях.Степень достоверности и апробация результатов.
Достоверность результатовподтверждает корректная статистическая обработка данных, а также – ихвоспроизводимость в независимых экспериментах. Материалы исследования былиопубликованы в 7 статьях в рецензируемых научных изданиях. Кроме того результатыданной работы были представлены на конференциях: Конференция ВОГиС «Проблемыгенетики и селекции» (Новосибирск, 2013); 17-я международная Пущинскаяшкола-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», (Пущино, 2013); 19-ямеждународная конференция по нейронаукам «Stress and behavior» (Санкт-Петербург,52013); 3-я международная конференция «Genetics of aging and longevity» (Сочи, 2014);Международная конференция «Биомедицинские инновации для здорового долголетия»(Санкт-Петербург, 2016); 23-я международная конференция по нейронаукам «Stress andbehavior» (Санкт-Петербург, 2016).
Материалы диссертации докладывали на семинарекафедры генетики и биотехнологии СПбГУ (Санкт-Петербург, 2017).Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзоралитературы, материала и методов исследования, результатов, обсуждения, заключения,выводов и списка цитируемой литературы, включающего 368 ссылок. Полный объемдиссертации составляет 175 страниц с 33 рисунками и 3 таблицами.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериал и методыВ работе использовали мышей высокоинбредных линий CBA, С3Н и BALB/с,полученных из питомника лабораторных животных «Рапполово» или SPF-виварияИнститута цитологии и генетики СО РАН.
Выбор линий осуществляли по контрастнымхарактеристикам (частота опухолеобразования), предположительно связанным состабильностью генома клеток (Peraino et al., 1973). Животных содержали в стандартныхусловиях группами по 5-6 животных. Всего было использовано 404 самца и 79 самокдомовой мыши. Материалом для анализа стабильности генома служил костный мозг (КМ)животных.Ольфакторные воздействия проводили по стандартной процедуре (Даев и др., 2012;Глинин и др., 2017).
Использовали водные растворы тестируемых веществ: 0,01% раствор2,5-диметилпиразина (2,5-ДМП) (Aldrich, 97%); хемосигналы мочи самок-одиночек (ХСО);хемосигналы мочи половозрелых котов. Растворами (0,5-1,5 мл) смачивалифильтровальную бумагу, которую помещали в перфорированную капсулу и располагали нарешетку клетки. Прямой контакт мышей с растворами исключали. Контролем служилоольфакторное воздействие дистиллированной водой.Для воздействия ХСО в некоторых случаях использовали смесь подстилок 10 самок,контролем служило действие чистой подстилки (Даев и др., 2012).В некоторых экспериментах дополнительными воздействиями служило тотальноеоблучение животных в дозе 4 Гр (РУМ-11, фильтр (0,5Cu+1Al), 180 кВ, 0,269 Гр/мин) или2-часовая иммобилизация (по Higoshimoto et al., 2013).Ана-телофазный метод анализа хромосомных аберраций (нарушений митоза) в клеткахКМ проводили по стандартной методике (Даев и др., 2009).
На стадии анафазы и телофазыанализировали частоту мостов, фрагментов, отставших хромосом и множественныхперестроек. У каждой мыши анализировали не менее 200 делящихся клеток.Метод щелочного кометного электрофореза. Для оценки поврежденности генома клетокКМ использовали стандартную методику щелочного кометного электрофореза (Дурнев идр., 2006) с небольшими модификациями. Клетки КМ в концентрации 2-3×105 клеток/млиммобилизовали в легкоплавкой агарозе (type VII, Sigma-Aldrich) на предметных стеклах,покрытых полилизином (Sigma-Aldrich). Далее препараты инкубировали со стандартнымлизирующим раствором, не содержащим DMSO, после чего проводили кометныйэлектрофорез с использованием камеры COMPAC-50 (Cleaver). Анализ «ДНК-комет»проводили с помощью программно-аппаратного комплекса (QImaging, QI Click) ипрограммы Comet Score™.
Поврежденными считали клетки, содержащие более 5% ДНК в«хвосте кометы» (Duthie, McMillan, 1997). Клетки, содержащие более 20% ДНК в «хвостекометы», считали сильно поврежденными.Определение концентрации гормонов в плазме крови. Образцы плазмы крови6анализировали на содержание кортикостерона, окситоцина, лютеинизирующего гормона(ЛГ) и тестостерона с помощью коммерческого набора для ИФА-анализа (Cusabio, ЗАО«АЛКОР-БИО»), следуя всем инструкциям производителей. Для определения оптическойплотности метки использовали планшетный спектрофотометр (Bio-Rad).Дополнительно, используя блокаторы катехоламинов (пропранолол, 10 мг/кг, Alinda) иглюкокортикоидов (метирапон, 30 мг/кг, Sigma-Aldrich), оценивали вклад стресс-гормоновв генотоксические эффекты используемых воздействий.Определение активности нейронов обонятельных луковиц методом функциональноймагнитно-резонансной томографии (фМРТ).
Исследование проводили с помощью 11,7 Ттомографа Biospec (Bruker, Германия). При этом запаховый стимул предоставляли спомощью ольфактометра, разработанного Отделом генофондов экспериментальныхживотных на базе ЦКП «SPF-виварий» ИЦиГ СО РАН.Хемосигналы предоставляли мышам, наркотизированным с помощью уретана(Sigma-Aldrich, 75 мг/кг), контролем служило предоставление чистого воздуха. Для каждоймыши получали 136 томограмм, из которых 40 были опытными и 96 контрольными.Анализ изображений проводили в пакете программ SPM8, приложении MATLAB.Кроме того, роль обонятельного эпителия носовой полости оценивали с помощью еговременной инактивации 10% раствором сульфата цинка.Статистическая обработка результатов. Весь статистический анализ проводили впрограмме GraphPad Prism 5TM.
В случае если распределение всех групп былонормальным, то для анализа использовали t-критерий Стьюдента и критерий ANOVA споправкой Тьюки. При ненормальном внутригрупповом распределении использоваликритерии Манна-Уитни и Краскела-Уоллиса. Для гомогенных данных использоваликритерий χ2. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.Результаты и обсуждениеВ работе было проведено 13 экспериментов (два из которых в двух независимыхповторностях) для изучения путей влияния различных стрессоров, в особенности –ольфакторных, на стабильность генома клеток костного мозга (КМ) домовой мыши.1.
Тестирование 2,5-ДМП и классических стрессоров на генотоксичность. На первомэтапе данной работы мы проверили способность 2,5-ДМП влиять на стабильность геномамышей трех разных линий: СВА, BALB/c и C3H. Было показано, что через 24 часа посленачала воздействия происходит статистически значимое повышение уровня нарушениймитоза (НМ) в клетках КМ самцов мышей всех трех линий (рис. 1, «А-В»), что можетсвидетельствовать в пользу неспецифичности кластогенного эффекта данного феромонадля домовой мыши.Кроме того, было обнаружено, что к повышению частоты НМ приводит ещё и 4- и48-часовое воздействие 2,5-ДМП, при этом пик повреждений приходится на 24 часа(увеличение частоты НМ в 2,1 раза, по сравнению с контролем) (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
