Диссертация (1145465), страница 82
Текст из файла (страница 82)
Стандартная систематемпературной стабилизации обеспечивала точность поддержания температуры в пределах ±1.0º от заданного значения. Никаких дополнительных способов подготовки образца (фильтрация,прогревание, обезгаживание и др.) не использовалось. Исключение составляют лишь усилия погерметизацииампулыдляподдержанияпостоянногообъемаобразцавтечениепродолжительных экспериментов, который может меняться из-за испарения хлороформа иприводить к изменению однородности магнитного поля. При работе со всеми стероиднымисоединенияминеоднократноотмечалось,чтонаилучшиерезультатывотношенииразрешающей способности могут быть достигнуты лишь через несколько суток после ихрастворения. Поэтому на первом этапе исследования, как правило, работа велась приотносительно низкой концентрации образца (5 – 7 мг на 5 мл СDCl3) на ядрах 1Н и лишь затемконцентация повышалась в (3 – 5) раза для проведения гетероядерных экспериментов.
В этойсвязи следует отметить, что помимо прочих достоинств, все исследованные стероидные388гормоны (кроме тетраенов и пентаенов) практически не разрушаются в течение нескольких летдаже при полном испарении растворителя, на свету и комнатной температуре.Таблица 6-1Методы корреляционной спектроскопии ЯМР, использованные в работеОтнесениеОпределение Определение№НазваниеметодаПараметрсигналов,1Н-{1Hi}213C-{1Hi}2-6JH-H1-3JC-HrH-Hnδ (м.д)корреляции11КССВ,Н13С○○1расстояний,Ji-j (Гц)Н-1Н13С-1Нri-j (Å)1Н-1Н13С-1Н●○○Литература[4, р. 91]●○[4, р.
121]3noe-difference●[4, р. 111]4INEPT1JC-H○●[4, р. 168; 52]5DEPT1JC-H○●[4, р. 168]6inadequate17INEPT-1inadequate18COSY-902-6JH-H●○[49]9COSY-DQF2-6JH-H○●[372]10DQ-COSY2-6JH-H○●[373]11SECSY2-6JH-H●○[374]12J-COSY2-6JH-H●●[375]13HETCOR1JC-H●●○[4, р. 375]14HSQC1JC-H●●○[41]15HSQCnd1JC-H●●○[41]16COLOC2-3●●JC-C●[53]JC-H,●[371]JC-CJC-H○[45]17 INADEQUATE118rH-H○○●[59]τex, rH-H●○○[59]○●[193, 194]NOESY19 EXSY-NOESYJC-C●20F.NOESYrH-H○21HOESYrC-H●● ‒ основное предназначение метода○ ‒ другие возможности метода●[4, р. 416]○[265]389Это позволяло возвращаться к объектам исследования даже через несколько лет, еслиоказывалось, что какие-то их спектральные или релаксационные особенности не вызвалиинтереса на первом этапе или просто по какой-то причине были пропущены.Для регистрации одномерных (1D) спектров на ядрах 1Н использовалось 16К точек, чтопри ширине спектральной области 8 м.
д. обеспечивало цифровое разрешение около 0.15 Гц, адля спектров на ядках13С шириной до 220 м. д. использовалось 32К точек, которые давалицифровое разрешение не хуже 0.5 Гц. Все двумерные (2D) спектры на ядрах1Нрегистрировались с использованием значительно меньшим числом точек (не более 2К), априемлемое цифровое разрешение по оси F2 результирующего 2D спектра обеспечивалосьдополнением нулями до 4К или 8К точек [376]. Число варьируемых t1-инкрементов,использующихся для получения второй координаты F1 двумерной матрицы обычно (взависимости от задачи) составляло от 64 до 256, а низкое цифровое разрешение по этой осикомпенсировалось процедурой дополнения нулями до 256 или даже до 1K точек.
Следуетотметить, что алифатическая область протонного спектра стероидных молекул, как правило,не превышает 3 м. д. и разрешающая способность конечного 2D-спектра оказывается вполнедостаточной для его качественного и количественного анализа. Аналогичный подходиспользовался и при регистрации гетероядерных (1Н-13С) 2D спектров: при инверснойрегистрации фрагмент такого спектра обычно находился в интервале от 0.5 до 3.5 м. д. по осиF2, а по оси F1 ‒ в интервале от 15 до 35 м. д., где располагается основная часть углеродныхсигналов СН-, СН2- и СН3-групп. В таких экспериментах величина задержки, оптимальной дляэффективного переноса поляризации через константу 1JC-H, устанавливалась на основаниизначения 125 Гц, которое характерно для этих групп: 1/(21JC-H) = 4.0 мс.
Длительность 90º-химпульсов для ядер 1Н и13С составляла 10 и 9.6 мкс. при их мощности0 и -3 дб,соответственно.Во временном представлении сигнала ЯМР, кроме дополнения нулями, применялось егоумножение на различные взвешивающие функции [377]. Среди них наиболее активноиспользовалось Лоренц-Гауссово преобразование [235], параметры которого LB и GBнаходились в пределах от -2.0 Гц до -4.0 Гц и от 0.2 до 0.4, соответственно. После Фурьепреобразования в частотном представлении дополнительно применялось разложение отдельныхкомпонент спектральных сигналов по гауссовым функциям – процедура “deconvolution” [200,205, 207, 378], что устраняло асиметрию экспериментальных линий и ее случайные шумовыеискажения. В результате при внимательном отношении к процедурам коррекции фазы ибазовой линии полуширина линии (∆ν1/2) достигала 0.38 Гц, а цифровое разрешение составляло0.009 Гц (см.
рисунок П6-1 в приложении П6)390Учитывая большую роль спектроскопии NOESY в настоящей работе и количественныеизмерения объемных интегралов, к регистрации этих 2D спектров предъявлялись повышенныетребования. Это, прежде всего, относится к получению спектров с высоким соотношениемсигнал/шум, которое достигалось достаточно продолжительным накоплением сигналасвободной индукции для каждого фиксированного значения времени t1: от 64 до 128повторений.Врезультатеобъемноеинтегрированиекросс-пиков,соответствующихмежпротонным расстояниям около 2.5 Å и времени смешивания ~0.5 с, проводилось сэкспериментальной погрешностью около ±2%, которая оценивалась путем измеренияинтегральной интенсивности шума в окрестности данного кросс-пика в тех же пределахконтура интегрирования, что и для этого кросс-пика (см. пример на рисунке П6-2 приложенияП6).
Поскольку подавляющее большинство сигналов за счет скалярных взаимодействий имеютбольшую ширину (до 50 Гц), то использовался прямоугольный (а не элипсоидный) контуринтегрирования.ПрипроведениинесколькиходинаковыхNOESY-экспериментовcразличными временами смешивания (τm) для каждого из кросс- или диагональных пиковиспользовался фиксированный контур интегрирования. Диапазон изменения τm составлялобычно около 1 секунды (от 0.2 до 1.2 с), а время релаксационной задержки D1 выбиралось так,чтобы полное время одного прохождения оставалось постоянным для любого значения τm: D1 +τm + AQ = Const. Обычно этот фиксированный интервал, включающий неизменное времявыборки данных (AQ), составлял от 2.2 до 3.0 с. Это означает проведение эксперимента вусловиях неполного релаксационного восстановления намагниченности (режим Fast NOESY[193‒195]) и предполагает дополнительные сложности сопоставления данных, полученных дляразных τm, если условие фиксированного периода повторения не выполнено.Шкала химических сдвигов всех зарегистрированных спектров на ядрах 1Н и 13С полученав результате калибровки сигнала растворителя СНСl3/CDCl3 на значения 7.26 и 76.9 м.
д.,соответственно. Более подробную информацию о параметрах регистрации и обработки данныхдля конкретных методов ЯМР можно найти в экспериментальной части работ [244, 321, 346,356, 365, 366].При определении термодинамических и кинетических параметров равновесныхобменных процессов использовались температурные зависимости скалярных констант, кточности измерения которых предъявлялись повышенные требования. Эта точность (не хуже±0.02 Гц) достигалась благодаря использованию высокотемпературного интервала измерения,который для хлороформа составлял обычно от 20 до 60 ºС, а также за счет примененияспециально разработанной процедуры обработки мультиплетного сигнала, которая включаласущественное увеличение числа добавленных нулевых точек (Zero filling – до 256К точек),391максимально возможное изменение параметров Лоренц-Гауссова преобразования (LB ≈ ‒ 4Гц, GB ≈ 0.4), использование разложения по гауссовым функциям всех компонентмультиплета и усреднение нескольких значений константы, полученных при ее измерении наразных парах одинаковых дублетов в составе одного мультиплетного сигнала.
Кроме того,уделялось большое внимание однородности магнитного поля и ее коррекции послеочередного изменения температуры.Свободные энергии активации для температуры коалесценции получены на основемодифицированного уравнения Эйринга для случая двухпозиционного обмена (А) ↔ (В) пометодике, которая дана в работе [379]:∆GA≠ = 4.57Tc[10.62 + log(X/2π(1 - ∆P) + log(Tc/∆ν)],/17/∆GB≠ = 4.57Tc[10.62 + log(X/2π(1 + ∆P) + log(Tc/∆ν)]./18/где Тс – температура коалесценции в °К, ∆ν – разность химических сдвигов в Гц, Х – 2π∆ντ(1/τ = 1/τA + 1/τB), величина log(X/2π(1 - ∆P) – определяется из графиков зависимости от ∆Р(∆Р = РА – РВ, РА + РВ = 1).
При подстановке всех значений в выражения /17 и /18/ свободныеэнергии активации ∆GA,В≠ получаются в кал/моль.Для расчетов молекулярной структуры стероидных молекул методами молекулярногомоделирования [380‒382] использовался пакет программ “HyperChem”, версия 5.1 [383].Расчеты неэмпирическим методом “аb initio” выполнены в базисе 6-31G. Расчетные значениявицинальных констант получены с помощью графической программы “MestRe-J” [97], аданные РСА о геометрии кристаллической структуры стероидных молекул, полученные сиспользованием компьютерной программы“SHELXL97” [384], вводились в программу“HyperChem” с помощью вспомогательной программы “xyz2hin” перевода из формата “XYZ”в формат “hin” для дальнейшей оптимизации методом молекулярной механики ММ+пространственного положения протонов при фиксированной геометрии углеродного скелета.Получившиеся новые данные в настоящей работе обозначались как “РСА+ММ+” или “РСА+”.Для симуляции 1D спектров ЯМР сложных спиновых систем использовалась программа“MestRe-C”, расчеты проводились с помощью РС-калькулятора и/или программы “Origin50”, адля подготовки рисунков использовалась стандартная компьютерная программа “Paint”.Полные названия использованных в работе методов ЯМР (см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
