Диссертация (1145465), страница 81
Текст из файла (страница 81)
357).‒При изучении 8α,10α-аналога андрогенов (46) с помощью измерения вицинальныхконстант был обнаружен быстрый в шкале времени ЯМР конформационный обмен, связанныйизменением пространственного строения кольца А (см. рис. 5-8 на с. 358 и рис. 5-9 на с. 360).Температурная зависимость констант 3J2β-1α и 3J2α-1β, измеренных с точностью ±0.02 Гц вдиапазоне температур от 20 до 50 ºС дала возможность оценить термодинамическиехарактеристики обменного процесса. Независимое подтверждение конформационного обмена(А)(В) было сделано на основании обнаруженного кросс-пика 11α/2β, существование383которого в спектре NOESY невозможно (r2β-11α(В) = 4.2 Å) без второго конформера (А), длякоторого r2β-11α(А) = 2.2 Å.‒Для8α,10α-аналога(47)и9β,10α-аналога(49)проведеносопоставлениеэкспериментальных и расчетных различий торсионных углов и скалярных констант в областикольца В.
Однако, при слишком большой величине этих различий по вполне понятнымпричинам этот подход не дает таких хороших результатов, как это было в примерахсопоставления структурно близких молекул с небольшими различиями их геометрическиххарактеристик (см. рисунок 5-11.1 на с. 364). Для обнаружения геометрических различиймодифицированных аналогов тестостерона (47) и (49) было также проведено сопоставлениегеминальных 2J6α-6β и дальних 4J4-6α, 4J4-6β констант (см.
рисунок 5-11.2 на с. 364), что позволилосделать достаточно вывод о том, что указанные скалярные константы могут являться не менеечувствительными критериями при установлении принадлежности модифицированных 19,Вбиснораналогов тестостерона к 8α,10α-изо- или 9β,10α-аналогам, чем вицинальная константа3J6α-8α,β. Во всяком случае, для всех изученных аналогов андрогенов эффективностьиспользования дальних скалярных взаимодействий протона 4 с соседними протонами через 4связи для идентификации их сигналов неоднократно демонстрировалась и не должнавызывать сомнений.Таким образом, конформационное разнообразие исследованных стероидных гормонов исвязанное с ним разнообразие спектральных проявлений и проблем, которые былиустановлены, проанализированы и решены в рамках одной изложенной выше методологииконформационного ЯМР-анализа, центральным (но не единственным) элементом которойявляется точная оценка межпротонных расстояний, дают все основания для успешногоиспользования разработанного подхода при исследовании других сложных органическихмолекул ‒ насыщенных полициклических соединений.Слова благодарности коллегам:Эта работа продолжалась слишком долго, чтобы теперь при ее завершении, вспоминая сблагодарностью всех ее участников, не забывая никого, поименно отметить роль каждого, ктотак или иначе участвовал в этой большой и интересной работе.
Какими словами можновыразить признательность и восхищение за утонченную спектральную красоту объектовисследования, созданных руками и знаниями моих коллег химиков-органиков. Как объяснитьи оценить роль стимулирующих обсуждений любых профессиональных вопросов с коллегамипо ЯМР-ному цеху… СПАСИБО ВСЕМ – хорошая была работа.Но среди тех, кто словом, делом или просто собственным примером повлиял на моевосприятие и отношение к спектроскопии ЯМР, не могу не вспомнить Анатолия ИвановичаКольцова и Николая Сергеевича Голубева и не поблагодарить судьбу за встречу с ними. 384Выводы1.Предложена, апробирована и использована новая эффективная методологияприменения спектроскопии ЯМР для конформационного анализа модифицированныханалогов стероидных гормонов, ключевыми элементами которой являются: полныйанализ спектра ЯМР 1Н, точное определение межпротонных расстояний на основеЯЭО, сопоставление относительных значений экспериментальных и расчетныхвицинальных констант и торсионных углов для доказательства небольших (в пределах10-15º) конформационных различий двух структурно близких стероидных молекул.2.Основной причиной заниженных или завышенных экспериментальных оценокмежпротонных расстояний, полученных для стероидных молекул на основе данныхспектроскопии NOESY и рассчитанных с использованием калибровочного метода,является анизотропия диффузии.
Учет анизотропного вклада в величины измеряемыхрасстояний, который для стероидных молекул в зависимости от выбора эталонногорасстояния может достигать ±20%, позволяет проводить оценку расстояний до 3.5 Å сточностью не хуже ±5%.3.Параметр анизотропии диффузионного движения (D║/D┴) стероидных молекул,который необходим для количественной оценки анизотропного вклада в погрешностьопределения расстояний, может быть установлен экспериментально спомощьюсравнения гетероядерных эффектов Оверхаузера (1Н→13С) от двух химическинеэквивалентных геминальных протонов, находящихся в углеродном скелетестероидной молекулы и имеющих различную пространственную ориентацию С‒Нсвязей относительно ее главной оси.
С помощью измерения гетероядерного (1Н-13С)эффекта Оверхаузера в метиленовой группе С17Н2 3-Метокси-16,16-диметил-D-гомо-Внор-8α-эстра-1,3,5(10)-триен-17а-она получена экспериментальная оценка параметраанизотропии D║/D┴, которая почти в 2.5 раза превышала ее расчетное значение.4.Высокая точность количественных оценок межпротонных расстояний с помощьюЯЭО в условиях экстремального сужения линий (ωоτс << 1) дает возможность безиспользования низкотемпературных измерений обнаруживать быстрые в шкалевремени ЯМР равновесные конформационные превращения даже при небольшой (~2%)населенности минорногоконформера, если в нем происходит значительноесближение пары протонов по сравнению с расстоянием между ними в доминирующем385конформере.
Для повышения чувствительности этого способа регистрации обменныхпроцессов эталонное расстояние должно выбираться с пространственной ориентациейего радиус-вектора вдоль главной оси стероидной молекулы, поскольку в этом случаетолько обменное усреднение наблюдаемого расстояния <rij> может приводить кзанижению его значения.5.В спектрах NOESY конформационно мобильных 17аβ-ацетокси-7α-метил-6-окса-D-гомо-8α,14β-эстра-1.3.5(10)-триенов в условиях быстрого в шкале времени ЯМРконформационногообменамеждусигналамискалярносвязанныхпротоновобнаружены кросс-пики аномальной полярности, являющиеся следствием вкладаскалярной релаксации 1-рода в кросс-релаксацию, определяемую диполь-дипольныммеханизмом.
Изучение этого явления позволило более точно сформулироватьнеобходимое условие для его возникновения ‒ наличие сильносвязанности протоновхотя бы в одном из двух конформеров, независимо от его населенности, а такжесделать вывод о возможности использования противоположных по знаку илизаниженных по интенсивности кросс-пиков в спектрах NOESY для доказательствасуществования быстрого в шкале времени ЯМР конформационного обмена.6.На основе разработанного подхода впервые проведено систематическое изучениеособенностей пространственного строения и внутримолекулярной подвижности врастворе широкого круга новых модифицированных аналогов стероидных гормонов:изоаналоговэстрогенов1,3,5(10),8(14)-тетраенов(эстра-1,3,5(10)-триенов,иэстра-1,3,5,7,9-иэстра-1,3,5(10),8(9)-иэстра-1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов)иизоаналогов андрогенов.7.Дляисследованныхстероидныхмолекулидентификация сигналов в спектрах ЯМР1Н ивпервыепроведенаполная13С, основанная на внутренних(косвенных и прямых, гомо- и гетероядерных) взаимодействиях, установлены схемыскалярного и пространственного связывания протонов и определены наборыскалярных констант {2-6JН-Н} и скоростей кросс-релаксации {σH-H}, а также полученынадежные экспериментальные доказательства внутримолекулярной жесткости иликонформационной подвижности этих стероидов.8.Впервые обнаружены и исследованы быстрые в шкале времени ЯМРконформационные превращения модифицированных аналогов стероидных гормонов,386связанные с изменением пространственного строения одного, двух или даже трехциклогексановых колец.
Для конформационно лабильных стероидных гормоновпроведена оценка населенностей конформеров в растворе CDCl3 и полученытермодинамические параметры обнаруженных динамических равновесий, а длянекоторых из них определены значения свободных энергий активации при температурекоалесценции.9.Конформационноеразнообразиеисследованныхстероидныхгормоновисвязанное с ним разнообразие спектральных проявлений и проблем, которые былиустановлены, проанализированы и решены в рамках предложенной методологии, даютоснования для рекомендации ее использования при исследовании других сложныхорганических молекул ‒ насыщенных полициклических соединений.387Экспериментальная частьВсе эксперименты проводилась на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР DPX-300фирмы “Брукер”, имеющего по протонному и по углеродному каналам рабочие частоты 300.13МГц и 75.468 МГц, соответственно. В работе использовались стандартные пакеты программимпульсных последовательностей и процедур обработки данных во временном и спектральномпредставлении этой фирмы: “ХWINNMR” и “Тopspin”, а также учитывались рекомендациифирмы-изготовителя спектрометра по подготовке, проведению и обработке полученных данныхдля каждого из ЯМР-экспериментов.
Перечень методов, их основное и дополнитеьноепредназначение приведены в таблице 6-1.Для регистрации сигнала свободной индукции использовался двухканальный датчикпрямой регистрации с отдельным каналом внутренней стабилизации на частоте ядер дейтерия.Из-за отсутствия датчика с инверсной регистрацией гетероядерные эксперименты HSQCпроводились без широкополосной развязки от ядер углерода-13 (HSQCnd – no decoupling) вдвух режимах: с рефокусировкой противофазной когерентности и регистрацией синфазныхдублетных сигналов или без рефокусировки с регистрацией противофазных дублетныхсигналов. Во втором случае время импульсной последовательности сокращалось почти в 2 раза,а последующая подстройка фазы по координате F2 не требовала больших усилий.В качестве растворителя использовался CDCl3, а при работе ниже -50 ºС ‒ СD2Cl2 и ацетон-d6.Вращение 5-ти миллиметровой ампулы с образцом использовалось только при прецизионныхизмерениях величин скалярных констант, которые для растворов в СDCl3 преимущественнопроводились в положительном температурном интервале от 0 до 60 ºС.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
