Диссертация (1145465), страница 79
Текст из файла (страница 79)
Она позволяет устранять возможные ошибки более ранних исследований спомощью независимого получения новых данных и сравнения их с предыдущимирезультатвми. Примеры переотнесения сигналов и даже “переаттестации” ранее описанныхстероидов в другие изоаналоги не так редки, как хотелось бы [370]. Поэтому так многовниманиявработебылоуделеноописаниюнезависимойсистемыдоказательств,базирующейся не на одном, а на множестве факторов (параметров).Таким образом, ЯМР-исследование 8α-аналогов эстрогенов, которое было изложено вовторой главе на примере 43-х стероидных молекул, можно рассматривать как пример первойстадии испытания эффективности предлагаемой методологии.
Здесь были апробированы всеее основные элементы:‒ Введение поправки на анизотропию диффузионного движения молекул в растворе напримере изучения 6-ти 8α-аналогов: (2а), (4а), (4б), (4в), (11б) и (11в) во всех случаях,независимо от выбора эталонного расстояния, приводилок существенному улучшениюкорреляции межпротонных расстояний с данными РСА и/или расчетных методов (точность нехуже ±5%),‒Использованиесопоставлениянеабсолютных,аотносительныхразличийэкспериментальных и расчетных величин скалярных констант 3Jij и торсионных углов θij длявыявления сравнительно небольших различий в пространственном строении двух стероидов,принадлежащих одному изоряду, на примере сопоставления нескольких пар 8α-аналогов(1а)↔(2а): изменение строения кольца D, (3а)↔(3б): влияние 7β-мeтильной группы,(7а)↔(7е): изменение строения кольца В, (6а) и (9а): изменение размера кольца В.‒Использование ЯЭО для обнаружения конформационного обмена и количественнойоценки населенности минорного конформера на примере изучения 4-х 8α-аналогов (1б), (2б),376(5б), (6и),‒Использование дальних констант для определения пространственной ориентациипар протонов: 8α↔11α (4б), 7α↔9α (3а), (3б), 6α↔4 (5а), 6α↔2 (5а), 6α↔2 (5а), 6β↔9α (5а),9α-1, 15α-17α (7д) на примерах изучения указанных 8α-аналогов.‒Экспериментальное определение параметра анизотропии диффузии D║/D┴ спомощью измерения гетероядерных эффектов Оверхаузера (HOESY) на примере D-гомо-Внор-8α-аналога (11в).Аналогичные способы извлечения и обработки информации были использованы втретьей главе при изучении других изоаналогов, принадлежащих 9β-, 13α-, 9β,14β-, 8α,14βаналогам и эстрогенам природного ряда.
При этом результаты использования методологиибыли такими же существенными, как и для 8α-аналогов.‒С учетом анизотропии диффузии проведена оценка 14-ти и 24-х межпротонныхрасстояний в 9β-аналогах (13) и (15), соответственно, а также10-ти расстояний в D-гомоаналоге природного ряда (21). При сравнении этих ЯМР-данных с результатами расчетовметодом ММ+ было получено, что среднеквадратичное отклонение (sd) составляло всего0.061, 0.07 и 0.055 Å, соответственно.‒Для9β-аналогов(12)и(15)проведеносопоставлениеотносительныхэкспериментальных и расчетных вицинальных констант и торсионных углов. В результатебыли получены следующие величины среднеквадратичного отклонения (sd): для констант –0.37 Гц, а для торсионных углов ‒ 1.9 º.
Это свидетельствует о высоком уровнечувствительности метода к конформационным различиям сравниваемых стероидов,‒ При изучении 8α,14β-аналогов эстрогенов (24) и (25а), (25б) было показано, что врастворе они существуют в виде двухпозиционного равновесия, связанного с одновременнымизменением конформации колец В и С в первом из них, а для D-гомо-6-оксааналогов (25)наблюдается одновременное изменение конформаций колец В, С и D.
В случае стероида (24),имеющего 5-членное строение кольца D, было показано, что равновесие смещено в сторонуболее плоской конформации и происходит с большей скоростью, чем в случае стероидов (25).Конформационное равновесие в 6-окса-D-гомо-8α,14β-аналогах (25а), (25б), наоборот,смещено в сторону “двухэтажного” конформера с аксиальными протонами 11α, 12β иаксиальной ориентацией 7α-метильной группы, а кольцо D в доминирующей форме (А)находитсявконформации“кресло”саксиальнымрасположениемпротона17аα.Пространственное строение конформеров (А) и (В) доказано с помощью скалярных констант иЯЭО.
Получены оценки термодинамических и кинетических параметров этого равновесия.Свободные энергии активации стероидов (24) и (25а) отличаются между собой на несколько377ккал/моль и для второго из них при комнатной температуре составляют ∆GA≠(298) = (14.7 ± 0.2)ккал/моль; ∆GВ≠(298) = (14.2 ± 0.2) ккал/моль. Эти значения были получены на основаниитемпературы коалесценции Tc, которые для большинства пар обменивающихся протоновнаходятся в пределах от -10 до 15 ºС.
Таким образом, быстрый в шкале времени ЯМРконформационный обмен в стероиде (25а) оказывается самым медленным из всехдинамических процессов, обнаруженных в настоящей работе. Более того, в спектрах NOESY6-окса-D-гомо-8α,14β-аналогов (25), полученных при температурах выше 40 ºС в условияхбыстрого в шкале времени ЯМР обмена, были обнаружены аномальные по знаку кросс-пикимежду скалярносвязанными протонами. В результате полного отнесения протонных сигналовконформеров (А) и (В) и линейной аппроксимации получившихся химических сдвигов вобласть высоких температур и их динамического усреднения было доказано, чтонаблюдаемый эффект изменения знака кросс-пика является результатом сильносвязанностипротонов 11β и 12α в минорном конформере (В) и проявления скалярной релаксации 1-города, вклад которой в скорость кросс-релаксации превышает диполь-дипольный вклад.
Этонаблюдение позволило сделать вывод о том, что наблюдение аномальных по знаку илизаниженныхпоинтенсивностикросс-пиковвспектрахNOESYявляетсяпрямымдоказательством существования быстрого в шкале времени ЯМР конформационного обмена.‒ На примере 9β-аналога (13) и D-гомоаналога природного ряда (20) показанавозможность использования дальней константы4J18``-12α = 1.5 Гц для определенияпреимущественной пространственной ориентации этильного фрагмента в положении 13.Дальние константы в спектре стероида (13) наблюдались также между экваториальнымипротонами 9β и 12β, которые регистрировались с помощью соответствующего кросс-пика вспектре COSY-DQF, а для стероидов (12) и (15) было проведено количественноесопоставление константы 4J1-9β и угла наклона связи С9‒Н9β по отношению к плоскости кольцаА.
Полученные значения 4J1-9β(12) = 1.27 Гц и 4J1-9β(15) = 1.43 Гц хорошо согласуются срасчетными (MM+) значениями торсионных углов: θ(Н9β-С9-С10-С1)(12) = 83.7° и θ(Н9β-С9-С10-С1)(15) =88.9°. Кроме того, на примере анализа сложного спектра 13α-аналога (16), которыйвыполнялся сиспользованием симуляции 9-ти спиновой системы, былапоказананеобходимость учета дальних констант для максимального соответствия экспериментальногои симулированного спектров. Дальние скалярные взаимодействия между экваториальными (вкольце С) протонами 9β, 12β и 14β были обнаружены в 9β,14β-аналогах (22), (23), в которыхтакже наблюдается достаточно большая константа 4J1-9β = 1.36 Гц.РазработаннаяЯМР-методологиябыланеменееуспешноиспользованадляконформационного анализа модификаций эстрогенов с дополнительными двойными связями:3781,3,5(10),8(9)- и 1,3,5(10),8(14)-тетраенов и 1,3,5,7,9- и 1,3,5(10),8(9),15(16)-пентаенов, а такжемодифицированных аналогов андрогенов, которые описаны в главах 4 и 5, соответственно.Среди наиболее характерных примеров ее эффективного использования следует отметитьнесколько достаточно удачных решений конкретных задач.‒В тетраене (26а) при определении 7-ми межпротонных расстояний калибровочнымметодом в качестве эталонного было выбрано расстояние 2.47 Å между ароматическимипротонами 1 и 2, радиус-вектор которого находится под углом 6 градусов к главной оси этоймолекулы.
При таком выборе сферическая модель расчета дала завышенные значениярасстояний по сравнению с данными РСА, а анизотропная модель дала результаты в пределах±5% от действительных значений. При этом среднеквадратичное отклонение (sd) составиловсего 0.06 Å. В случае оценок аналогичным способом 16 расстояний в 9β,10α-аналоге 19,Вбиснортестостерона (50)в качестве эталонного было выбрано расстояние 1.77 Å междугеминальными протонами 1α и 1β, радиус-вектор которого ориентирован под углом 72º кглавной оси молекулы. Поэтому сферическая модель расчета дала, наоборот, заниженныезначения ЯМР-расстояний по сравнению с расчетными данными полуэмпирического методаРМ3. Но также как и в предыдущем случае, использование аксиально-симметричной(анизотропной) модели расчета дало результаты в пределах ±5% от действительных значений(sd = 0.055 Å).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
