Автореферат (1141394), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Уровень бракованной продукции в сериях ЛХС-1208 в зависимости отобъема наполнения флаконов и режима лиофилизацииРисунок 3. Температурный график режима лиофилизации раствора ЛХС-1208 насублимационной сушке Minifast 101.2.2. Изучение стабильности раствора, полученного после регидратацииИЛФ-лио ЛХС-1208В связи с необходимостью в процессе проведения биологических и другихэкспериментов хранили раствор, полученный после растворения ИЛФ-лио ЛХС1208 с помощью воды для инъекций, оценивали происходящие в нем изменения втечение 24 часов.
Оказалось, что данный раствор стабилен по показателям –внешний вид, значение рН и содержание ДВ в течение всего срока исследования.122. Разработка методик контроля качества ИЛФ-лио ЛХС-12082.1. Разработка методики ТСХ для качественного анализа ИЛФ-лио ЛХС-12082.1.1. Методика ТСХ-анализа ЛХС-1208 и Kollidon 17 PFМетодика проведения анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят по 5 мклисследуемого образца ИЛФ-лио ЛХС-1208 (содержание ЛХС-1208 в наносимойпробе 5,0 мкг, Kollidon 17PF – 335,0 мкг) и СОВС: ЛХС-1208 (СОВС-1 – 5,0 мкг) иKollidon 17PF (СОВС-2 – 335,0 мкг).После подсушивания на воздухе в течение 10-15 мин. пластинку снанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру, предварительнонасыщенную смесью бензол/спирт 95% (1:1), плотно закрывают крышкой ихроматографируютвосходящимспособом.Когдарасстояниеотфронтарастворителей до конца пластины составляет 1 см, т.е.
после достижения фронтомэлюента линии финиша (пробег 12 см), пластинку вынимают из камеры ивысушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя.ЛХС-1208 идентифицируют на пластинке визуально по характерному желтомупятну (Rf=0,66) без использования специфических реактивов. Для обнаруженияKollidon 17PF (Rf=0) пластинку помещают в камеру, насыщенную парами йода, ивыдерживают около 1 мин до появления светло-желтого пятна на старте.2.1.2.
Методика ТСХ-анализа Kollidon 17 PFМетодика проведения анализаНа линию старта хроматографической пластинки наносят по 5 мклисследуемого образца ИЛФ-лио ЛХС-1208 (содержание ЛХС-1208 в наносимойпробе 5,0 мкг, Kollidon 17PF – 335,0 мкг) и СОВС Kollidon 17PF (СОВС-2 – 335,0мкг).После подсушивания на воздухе в течение 10-15 мин.
пластинку снанесенными пробами помещают в хроматографическую камеру, предварительнонасыщенную смесью спирт 95% / 25% аммиак (3:2), плотно закрывают крышкой ихроматографируютвосходящимспособом.Когдарасстояниеотфронтарастворителей до конца пластины составляет 1 см, т.е. после достижения фронтомэлюента линии финиша (пробег 12 см), пластинку вынимают из камеры ивысушивают в потоке теплого воздуха до полного удаления запаха растворителя.13Для обнаружения Kollidon 17PF (Rf=0,69) пластинку помещают в камеру,насыщенную парами йода, и выдерживают около 1 мин до появления светложелтого пятна.2.1.3. Выбор подвижной фазы для ТСХ ЛХС-1208 и Kollidon 17 PFНа данном этапе было изучено 12 типов элюирующих систем различногосостава.
Как видно из полученных результатов, представленных в табл. 2, наразделение хроматографических зон влияет качественный состав подвижной фазы,однако практически во всех системах при просмотре хроматограмм в УФ-свете снанесенными образцами помимо круглого пятна желтого цвета, котороесоответствует ЛХС-1208, наблюдалось хорошо очерченное круглое светло-желтоепятно на старте, которое соответствует Kollidon 17 PF.Таблица 2Эффективность ПФ при ТСХ-анализеИЛФ-лио ЛХС-1208 на хроматографических пластинках SorbfilРастворителиВремяанализа,минЗначение RfИЛФ-лио ЛХС-1208СОВС-1СОВС-2ЛХС-1208Kollidon 17 PFацетон: этилацетат: вода (10:4:1)бензол: ацетон (1:1)бензол: спирт 95% (1:1)н-бутанол: н-гексан (1:1)пропанол-2: 25% аммиак (10:1)пропанол-2: 25% аммиак: ацетон (2:1:3)хлороформ: метанол (5:1)хлороформ: спирт 95%: ледянаяуксусная кислота (8:4:1)354030180160100900,5300,660,3300,580,7700000000,5300,660,3200,590,7600000001000,7500,730спирт 95%спирт 95%: 25% аммиак (3:2)этилацетат: спирт 95%: 25% аммиак(9:1:2)1801800,79000,690,78000,69500,3600,350Система бензол/спирт 95% (1:1) была отобрана среди всех системрастворителей для определения ЛХС-1208 (Rf=0,66), поскольку процедура еепроведения является самой непродолжительной по времени (30 мин.).
Системаспирт 95% / 25% аммиак (3:2) была выбрана для определения Kollidon 17 PF(Rf=0,69), т.к. в этой подвижной фазе удалось поднять Kollidon 17 PF над стартовойлинией. С учетом того, что совместный анализ компонентов ИЛФ-лио ЛХС-120814затруднен, а каждая из этих систем растворителей подходит для идентификациитолькоодногоизкомпонентовИЛФ-лиоЛХС-1208,топредставляетсяцелесообразным качественный анализ ЛХС-1208 и Kollidon 17 PF проводитьотдельно.
Проведена оценка пригодности выбранной хроматографической системыдля ТСХ-анализа компонентов ИЛФ-лио ЛХС-1208 путем определения пределаобнаружения вещества. Пределы обнаружения компонентов ИЛФ-лио ЛХС-1208 иоценка пригодности системы приведены в диссертации.2.2. Разработка и валидация методики спектрофотометрического анализаЛХС-1208 в ИЛФ-лиоСубстанция ЛХС-1208 одинаково хорошо растворима в ДМСО и ДМФА,однако для проведения спектрофотометрического анализа необходимо применятьнаиболее прозрачные растворы, поэтому измерения проводили для растворов ЛХС1208 в ДМФА, которые имеют характерные электронные спектры поглощения(ЭСП): в области 200–500 нм наблюдаются максимум поглощения при 287±2 нм,плечо при 306±2; максимум поглощения при 320±2 нм, плечо при 343±2 нм, слабоинтенсивный максимум при 420 нм (рис.
4).Рисунок 4. ЭСП субстанции ЛХС-1208(0,0006% раствор в ДМФА)Рисунок 5. ЭСП раствора ЛФ-лио ЛХС1208 (0,0006% раствор в ДМФА)Рабочей концентрацией раствора ЛХС-1208 выбрали концентрацию 0,006мг/мл – 0,008 мг/мл; при этом величина оптической плотности укладывается винтервал, рекомендуемый ГФ XIII, а максимумы поглощения в растворахсубстанции и ЛФ совпадают (рис. 5).На разных этапах разработки ЛФ в состав моделей включались такие ВВ какДМСО, Cremophor ELP, Kollidon 17PF в разных количествах. На рис. 6 и 7представлены ЭСП растворов Cremophor ELP с ДМСО и Kollidon 17PF в ДМФА.Эти растворы в области 270 нм – 350 нм не имеют собственного поглощения и,15следовательно, присутствие Cremophor ELP, ДМСО и Kollidon 17PF не мешаетопределениюДВ.Вкачестверастворасравнения,поэтому,возможноиспользование ДМФА без добавления ВВ.В максимуме при λmax 320 нм наблюдается более интенсивное поглощение,поэтому он был выбран в качестве аналитического сигнала.
Для снижениясистематических и случайных ошибок при определении ЛХС-1208 в ЛФ вметодику спектрофотометрического анализа ввели способ расчета по стандартномуобразцу (СО). В качестве СО использовали субстанцию ЛХС-1208.Исходя из вышеизложенного, ЭСП ЛХС-1208 может использоваться дляидентификации и количественного определения ЛХС-1208 в ИЛФ-лио, априменяемая методика спектрофотометрического анализа ЛХС-1208 являетсяспецифичной.Рисунок 6. ЭСП раствора Cremophor ELPс ДМСО в ДМФАРисунок 7.
ЭСП раствора Kollidon 17PFв ДМФАЛинейность методики подтверждали измерением аналитических сигналовдля 5 проб с различными концентрациями ЛХС-1208 в модельной смесикомпонентов ЛФ в пределах диапазона от 80 до 120% от заявленного содержания впрепарате (9,0 мг/флакон). Значение коэффициента корреляции составило 0,9999,что свидетельствует о наличии достаточно тесной линейной связи междуконцентрацией ЛХС-1208 и оптической плотностью в заданном диапазонеконцентраций.
Уравнение регрессии для данной линейной зависимости имеет виду=0,3127х-0,0006.Определение правильности методики проводили методом добавок намодельных смесях компонентов ЛФ ЛХС-1208, вносимого в концентрациях 80, 100и 120% от заявленного содержания в препарате. Установлено, что отклонения от16среднего значения (9,0±0,01) укладываются в интервал концентраций ЛХС-1208(8,1-9,9 мг/флакон),заявленных в проекте НД наИЛФ-лио ЛХС-1208,относительная погрешность среднего результата не превышает 1%.Повторяемость методики оценивали по результатам, полученным водинаковых условиях в одной лаборатории одним и тем же исполнителем впределах короткого промежутка времени на 6 образцах ИЛФ-лио ЛХС-1208 однойсерии.
Коэффициент вариации составил значение 0,075%, что свидетельствует онезначительной изменчивости вариационного ряда и прецизионности методики вусловиях сходимости. Относительная погрешность определения не превышала 1%.Дляподтверждениявнутрилабораторнойпрецизионностиизмерялисодержание ЛХС-1208 в 6 пробах ИЛФ-лио одной серии, полученных в условияхработы одной лаборатории разными аналитиками в разные дни. При сравнениирасчетного и табличного значения критерия Стьюдента выполнялось неравенствоtрас=0,33<tтаб=2,23, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибкиизмерений. На основании вышеизложенного можно сделать вывод о том, чторасхождения результатов анализа, полученных двумя исследователями, случайны.Приготовление СО ЛХС-1208Точную навеску субстанции ЛХС-1208 9,0 мг количественно переносят вмерную колбу вместимостью 50 мл и доводят ДМФА до метки (раствор А),перемешивают.
Отбирают 1 мл раствора А в колбу вместимостью 25 мл и доводятДМФА до метки (раствор Б). Раствор Б используют свежеприготовленным.А. Методика спектрофотометрического определения ЛХС-1208 в ИЛФ3 мл ИЛФ ЛХС-1208 помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл идобавляют небольшое количество ДМФА, перемешивают, доводят ДМФА дометки и перемешивают (раствор А). 1 мл раствора А помещают в мерную колбувместимостью 25 мл, доводят ДМФА до метки и перемешивают (раствор Б).Измеряют величину оптической плотности раствора Б в кюветах с толщинойоптического слоя 10 мм в максимуме поглощения относительно растворасравнения. Параллельно проводят измерение оптической плотности раствора СОсубстанции ЛХС-1208 относительно раствора сравнения.1208 в ИЛФ (Х, мг/мл) рассчитывают по формуле:Х= А×а0/ А0×1,17Концентрацию ЛХС-где: А и А0 – соответственно оптические плотности растворов образца ИЛФи СО ЛХС-1208; а0 – навеска СО ЛХС-1208, в мг; 1 – 1 мл образца ИЛФ ЛХС-1208.Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
