Автореферат (1141373), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Регистрация масс-спектров: энергия ионизации 70 эВ, температура источника 200 0С,температурный диапазон 100-300 0С со скоростью нагрева 100 0С/мин, сканирование в диапазоне10-600 Да со скоростью 1 скан/с (для терпеноидов). Запись результатов проводится согласно ГФXIII, т.1, ОФС.1.2.1.1.0008.15.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ1. Изучение морфолого-анатомического строения корней шалфея лекарственногоМакроскопические признакиОдним из критериев установления подлинности сырья являются морфологическиепризнаки.
Сырьем для исследования служили подземные органы шалфея лекарственного10(корневища с корнями, в дальнейшем корни). Главное корневище крупное, от него отходятмногочисленные тонкие корни. Цвет пробки корневища темно-бурый или черный. Корневищелегко ломается, излом светло-кремового цвета.
Оно имеет слегка извилистую форму, длину около10-20 см, длина корней примерно 15-20 см. Диаметр корневища у основания 2-3 см, постепенносужающийся до 1-0,5 см.Микроскопические признаки123Рисунок 1 – Фрагмент поперечного срезаРисунок 2 – Фрагмент поперечного срезакоры (I-пробка, 2-парехима коры, 3-флоэмы (ув. 400х)оранжевые включения ройлеанонов) (ув.100х)Рисунок 3 – Фрагмент поперечного срезаРисунок 4 – Фрагмент продольного срезафлоэмы (I-идиобласты с крист. оксалатакоры.
Одностороннеутолщенныекальция) (ув. 400х)идиобласты (ув. 400х)11132Рисунок 5 – Фрагмент поперечного срезаРисунок 6 – Фрагмент поперечного срезадревесины (I-сосуды ксилемы, 2-коры и древесины (ув.200х)либриформ, 3-сердцевинный луч) (ув.200х)Для приготовления препаратов использовались корни диаметром от 1 до 20 мм. Прирассмотрении поперечного среза видна крупноклеточная легко отделяющаяся пробка. Клеткипаренхимы коры, крупные, тангентально-вытянутые, другие более мелкие, расположенныерадиальными рядами. Клетки паренхимы коры и сердцевинных лучей содержат оранжевые илисеровато-оранжевые включения.
Они служат местом локализации ройлеанонов. В коре встречаютсяодиночные или небольшими группами клетки-идиобласты, в полости которых находятсяпризматические кристаллы оксалата кальция. Древесина корня имеет многочисленные одно-двух,реже трех-четырехрядные сердцевинные лучи, четко выраженные годичные кольца. Сосудыдревесины с окаймленными порами лежат одиночно, изредка по 2-3, встречаются трахеиды, волокналибриформа и клетки древесной паренхимы, расположенные продольными рядами вблизи крупныхсосудов. Все элементы древесины и клетки сердцевинных лучей сильно одревесневшие.На Рисунке 1 видны отдельные включения ройлеанонов оранжевого цвета. На Рисунке 2видны односторонне-утолщенные идиобласты с кристаллами оксалата кальция (I); в клетках флоэмы– оранжевые зернистые включения (2).
На Рисунке 3 видны широкие ситовидные трубки,сердцевинный луч и зернистые включения оранжевого цвета в клетках флоэмы (2). На Рисунке 4видны многочисленные призматические кристаллы оксалата кальция (I). На Рисунке 5 видныгодичные кольца древесины и 1-3 рядные сердцевинные лучи с включениями ройлеанонов.Установлены морфолого-анатомические характеристики сырья – корневища с корнямишалфеялекарственного,позволяющиеподтвердитьегоподлинность.Поданныммикроскопического исследования установлено, что ройлеаноны локализованы в клетках паренхимыкоры и в сердцевинных лучах.122.
Изучение компонентного состава ройлеанонов корней шалфея лекарственного.Сопоставление антимикробной активностиС целью обоснования возможности получения субстанции антимикробного действия изкорней шалфея лекарственного было проведено изучение компонентного состава ройлеанонов висходном сырье. Методом колоночной хроматографии из хлороформного экстракта быливыделены ройлеанон (I), 7-ацетоксигорминон (II), горминон (III), 7-оксогорминон (IV) (Рисунок 7).Указанныевеществаидентифицированыпотемпературеплавления,идентичностихроматографического поведения с аутентичными образцами на ТСХ в системе 100% хлороформ,по данным 1Н ЯМР спектров, представленным в Таблице 1, и масс-спектров.
Наличие таксохинона(IIIa) и 6,7-дегидроройлеанона показано путем анализа 1Н ЯМР спектра смеси веществ.Рисунок 7 – Структурные формулы выделенных ройлеаноновТаблица 1Параметры сигналов 1Н ЯМР спектра ройлеаноновПараметрысигналовСоединенияI (CDCL3)ройлеанонт.пл. 179-1810СII (CDCL3)7-ацетоксиройлеанонт.пл. 212-214 0СIV (CDCL3)7-оксоройлеанонт.пл.198-200 0С (лит.214-215 0С2,75 м; 2,82 мIII (CDCL3)7-гидроксиройлеанон(горминон)Т.пл. 177-1780С2,66 м; 2,76м2,71 м; 2,73м1,93м; 1,73м1,51м; 1,61м5,81м3,15 спт (7 Гц)1,18 д (7 Гц)1,25д (7 Гц)0,92 с0,95 с1,30 с7,14 с2,02 с4,73 м3,15 спт(7Гц)1,19 д (7 Гц)1,22 д (7 Гц)0,98 с0,98 с1,25 с2,67дд (18,2Гц; 4,5Гц)2,49дд (18,2 Гц; 13,5 Гц)ОтнесенияН-1Н-5Н-6Н-7Н-15Н-16Н-17Н-18Н-19Н-2012-ОНСН3СО3,15 спт (7 Гц)1,18 д (7 Гц)1,21д (7 Гц)0,89 с0,93 с1,25 с7,25 с2,89м; 2,83м1,82 дд (13,5 Гц; 4,5Гц)3,18 спт (7 Гц)1,21 д (7 Гц)1,25д (7Гц)0,92 с0,98 с1,35 с7,05 сСокращения: с-синглет, д-дублет, м-мультиплет, спт-септет, дд-дублет дублетов.13В корнях шалфея лекарственного в следовых количествах содержится стереоизомергорминона, таксохинон, с аксиальной ориентацией Н-7.
О наличии таксохинона внеперекристаллизованном горминоне свидетельствуют характеристические сигналыдублет 3,8 м.д., J=2,2 Гц (7-ОН) и квартет дублетов 2,19 м.д., Jгем=12,7 Гц, J6a,7a=7,3 Гц (Н6а).Ройлеанон и 6,7-дегидроройлеанон имеют практически одинаковое хроматографическоеповедение и элюируются с колонки в смеси. В спектре 1Н ЯМР 6,7-дегидрорйлеанон даетхарактеристические дублеты дублетов при 6,46 и 6,81 м.д., по которым идентифицируетсяв смеси с ройлеаноном. О выделении из корней шалфея лекарственного 7-оксоройлеанонадо настоящего времени не сообщалось (Таблица 1).Помимо идентификации всех выделенных нами 6 ройлеанонов необходимо былоподтвердить их нативный характер.
Все выделенные и очищенные перекристаллизациейройлеаноны (I-IV) были охарактеризованы методом ВЭЖХ определением времениудерживания. Все пики с соответствующими временами удерживания присутствовали наВЭЖХ-хроматограмме спиртового экстракта корней шалфея лекарственного, чтопоказывает нативный характер выделенных соединений.Выделенные нами индивидуальные ройлеаноны были охарактеризованы по ихантимикробной активности.
Это дало возможность сопоставить их значимость дляантимикробного препарата, а также отметить определенную связь между строениеммолекулы и антимикробной активностью.Таблица 2Значения антимикробной активности в отношении Staphylococcus aureus дляисследуемых веществ:ВеществоАктивность, мкг/млРойлеанон62,5Горминон15,6Таксохинон(минорныйкомпонент, 15,6 (частично 7,8)стереоизомер горминона)7-ацетоксигорминон62,57-оксоройлеанон31,26,7-дегидроройлеанон1000Как видно из приведенных данных (Таблица 2), наибольшая антимикробнаяактивность в отношении золотистого стафилококка (15,6 мкг/мл) наблюдается усоединений со свободной гидроксильной группой при С-7 (горминон, таксохинон).14Несколько ниже, при наличии у С-7 оксогруппы (31,2 мкг/мл).
При отсутствии в этомположении кислородной функции (ройлеанон) или ацилировании гидроксигруппы (7ацетоксиройлеанон) активность еще более низкая (62,5 мкг/мл). При дегидратации иобразовании двойной связи (6,7-дегидроройлеанон) активность резко падает (1000 мгк/мл).Таким образом, наиболее предпочтительным компонентом в составе субстанцииантимикробного действия является горминон.Для подтверждения структуры выделенных соединений была использована массспектрометрия, где применяется электронный спрей, обуславливающий более мягкуюионизацию.
При этом в отличие от фрагментации под действием электронного ударавыявляются определенные общие закономерности распада ройлеанонов. На первом этапераспада происходит отрыв воды от протонированной молекулы ройлеанона, далее имеетместо разрыв связей С1-С10 или С4-С5 с последующим отщеплением соответствующихфрагментов от линейной цепочки (Рисунок 8).Рисунок 8 – Распад молекулы ройлеанона под действием электронного спреяПентациклические тритерпены К многокомпонентному лекарственному препаратурастительного происхождения предъявляются требования характеристики химической природыне только действующих, но и сопутствующих компонентов. Методом колоночнойхроматографии на силикагеле с последующей рехроматографической очисткой было выделено5пентациклическихтритерпеноидов:олеаноловая,урсоловая,эускафиковая,19-дезоксиэускафиковая и 2α,21β,22α-тригидроксиолеаноловая кислоты.
Олеаноловая и урсоловаякислоты выделены в смеси. Характеристическими параметрами в 1Н ЯМР спектре смеси кислотявляются сигналы протона при С-18: для олеаноловой кислоты дублет дублетов 2,85 м.д. (βамириновый скелет), для урсоловой – дублет 2,2 м.д. (производные α-амирина). Присутствие всмеси урсоловой кислоты подтверждается наличием двух дублетов 0,85 и 0,94 м.д.Эускафиковая (IX) и 19-дезоксиэускафиковая (X) кислоты идентифицированы по сумме данныхН ЯМР и масс-спектров.
В масс-спектре IX присутствуют пики m/z 488, m/z 264, m/z 248 (циклы1DE) и m/z 223 (циклы AB), которые связаны с ретро-диеновым распадом (РДР) молекулы посвязям С-9, С-11 и С-8, С-14 цикла С при наличии Δ12 (Рисунок 9). Карбоксильная группа, по15биогенетическим соображениям расположена при С-17. Положение третьей кислороднойфункции, ОН-группы, в цикле Е при С-19 и урсановый скелет IX следует из данных 1Н ЯМРспектра: синглет Н-18 при 2,52 м.д., дублет СН3 – группы при С-20 0,94 м.д. (J=6,5 Гц).Наличие двух ОН-групп при С-2 и С-3 и их взаимное пространственное расположениеотвечает структуре эускафиковой кислоты.Торментоловая кислота (литературные данные) Н-2: 3,64 м.д., ддд, 10,0 Гц, 11,0 Гц, 3,0Гц; Н-3: 2,92 м.д., д;Эускафиковая кислота (литературные данные) Н-2: 3,93 м.д., ддд, 11,3 Гц, 3,5 Гц, 3,1Гц; Н-3: 3,33 м.д., д;Вещество IX (экспериментальные данные) Н-2: 3,93 м.д., ддд, 12,0 Гц, 3,0 Гц, 2,8 Гц; Н3: 3,29 м.д., д.Рисунок 9 – Фрагментация молекулы эускафиковой кислоты под действием электронногоудараАналогичным образом идентифицирована 19-дезоксиэускафиковая кислота (X).Параметры 1Н ЯМР и масс-спектров практически совпадают с соответствующими параметрамиIX.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
