Автореферат (1141344), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Методологическая основа работы при выборе методов анализа заключалась в изучении биологической природы препарата, его физико-химических свойств, особенностях определения в условиях in vitro и in vivo, подборе оптимальных условий количественного определенияактивности НМГ, пробоподготовки и фармакокинетических расчетов. В процессевыполнения работы был использован метод планшетной УФ-спектрофотометрии,кюветной УФ-спектрофотометрии.Достоверность научных положений и выводовДиссертационная работа выполнена на современном научно-методическомуровне.
В ней использованы методики исследования, адекватные целям и задачам.7Использованное в работе оборудование имело действующие свидетельства о поверке и зарегистрировано в Реестре средств измерений, что позволяет считать результаты исследования достоверными. Данные, полученные автором, достоверны,обработаны с применением методов современной статистики («Руководство поэкспертизе лекарственных средств», том 1, том 4). Научные положения, выводы ирекомендации, сформулированные в диссертационной работе, обоснованы, достоверны и логично вытекают из полученных автором данных. Первичная документация многократно проверена и полностью соответствует материалам, содержащимся в данной работе (акт №124/Р от 01.12.14 выдан комиссией ГБОУ ВПО ПервыйМГМУ им.
И.М. Сеченова Минздрава России).Апробация результатов исследованияОсновные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийскойконференции "Татьянин день", Москва, 2012г.; научно-практической конференциис международным участием «Разработка и регистрация лекарственных средств:прикладные аспекты», Москва, 2013 г.; V научно-практической конференции «Актуальные проблемы оценки безопасности лекарственных средств», Москва, 2014 г;VII Научно-практическая конференция «Актуальные проблемы оценки безопасности лекарственных средств», Москва, 2016.
Апробация работы проведена на конференции ученых НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М СеченоваМинздрава России (12.02.16).Личный вклад автораАвтору принадлежит основная роль в проведении экспериментальных исследований, анализе и обобщении полученных результатов.
Автором лично проведена разработка, валидация методики определения активности эноксапаринанатрия (в оригинальном и воспроизведенном ЛС), проведено сравнительное исследование препаратов эноксапарина натрия: оригинального и разрабатываемого вусловиях in vitro и in vivo, а также статистическая обработка результатов анализа.Вклад автора является определяющим на всех этапах исследования: от постановкизадач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатовв научных публикациях, докладах и внедрения в практику.8Внедрение результатов исследованияРазработанные спектрофотометрические методики количественного определения анти-Ха и анти-IIа активности эноксапарина натрия были включены в международную базу аналитических решений Agilent Technologies, а также в работулаборатории фармакокинетики и лекарственных форм ФГБУН НЦБМТ ФМБАРоссии и лабораторию биофармацевтических исследований ООО «Центр Фармацевтической Аналитики».
Данные методики могут быть использованы для оценкивзаимозаменяемости препаратов-биоаналогов низкомолекулярных гепаринов настадии разработки и регистрации препаратов. Результаты сравнительного исследования препаратов-биоаналогов входят в состав регистрационного досье отечественного ЛС эноксапарина натрия, разрабатываемого в рамках государственногопроекта (акты внедрения ФГБУН НЦБМТ ФМБА от 19.01.16, ЦФА от 19.01.16,Agilent Application Note № 5991-2509RURU).Соответствие диссертации паспорту научной специальностиНаучные положения диссертации соответствуют специальности 14.04.02«Фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 3 –«Разработка новых, совершенствование, унификация и валидация существующихметодов контроля качества лекарственных средств на этапах их разработки, производства и потребления» и 4 - «Разработка методов анализа лекарственных веществи их метаболитов в биологических объектах для фармакокинетических исследований» паспорта специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтическихнаукДиссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы НИИ Фармации Первого МГМУ имени И.М.
Сеченова «Развитие научных и научнометодических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств». Номер государственной регистрации01.2.012.61653.9ПубликацииПо теме диссертаци опубликовано 6 работ, 3 из которых в журналах, рекомендованных ВАК, в которых полностью отражены результаты проведенных исследований.Объем и структура диссертации.Диссертационная работа изложена на 131 страницах компьютерного текста,состоит из введения, обзора литературы (1 глава), описания материалов и методов(глава 2), методики разработки и валидации определения активностей эноксапарина натрия в условиях in vitro и in vivo (глава 3), результатов сравнительных исследований препаратов-биоаналогов НМГ эноксапарина натрия в условиях in vitro и invivo (глава 4 и глава 5), общих выводов и списка литературы. Библиографическийсписок содержит 112 источников, из них 79 на иностранном языке.СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫМатериалы и методыВ качестве объектов исследования были взяты: исследуемый препарат - препарат-биоаналог «Эноксапарин натрия», раствор для инъекций 10000 анти-Ха российского производства; референтный препарат - Клексан®, раствор для инъекций8000 анти-Ха МЕ/0,8 мл, производства САНОФИ-АВЕНТИС ФРАНС, произведеноСанофи Винтроп Индустрия, Франция.
Для каждого из исследуемых ЛС использовалось по 6 доступных серий.Для проведения определения анти-Ха и анти-IIа активности препаратов НМГэноксапарина в условиях in vitro и in vivo, было использовано следующее оборудование: Микропланшетный ридер Mindray MR-96A, производитель Shenzhen MindrayBio-Medical Electronics Co., Ltd.; УФ-спектрофотометр Agilent Technologies Cary 60UV-Vis; УФ-спектрофотометр ПЭ-5400УФ, ПРОМЭКОЛАБ, Санкт-Петербург;рН/мВ-метр pH 330i; рН-метр 728 рН lab, MetrohmAG, термошейкер Biosan PST60HL для 96-луночных планшетов; термошейкер Biosan TS-100С для пробирок Эппендорфа, вортекс-шейкер Heidolph, Reaxtop; дозаторы одноканальные переменногообъема Ленпипет Лайт 10 – 100 мкл, 100 – 1000 мкл, 1 – 10 мл; дозаторы восьмиканальные переменного объема Ленпипет Лайт 5 – 50 мл и 30 – 300 мкл.10В работе использовали следующие реактивы и материалы: вода деионизированная; уксусная кислота ледяная (Scharlau, Испания, класс «х.ч.»), натрия хлорид(х.ч.), реагенты для определения анти-Ха и анти-IIa активности НМГ в условиях invitro (состав: антитромбин III (1 IU/фл), лиофильно высушенный; фактор Xa (15нкат/фл), лиофильно высушенный; тромбин (фактор IIa) (20 NIH/фл), лиофильновысушенный; хромогенный субстрат для фактора Ха, лиофильно высушенный (2,0мл); хромогенный субстрат для тромбина, лиофильно высушенный (2,0 мл); рабочий Стандартный Образец НМГ; концентрат буфера (5 мл); бычий сывороточныйальбумин, реагенты для определения анти-Ха активности гепарина оптическимметодом «Реахром Гепарин» (НПО «Ренам», Россия); реагенты для определенияанти-Ха и анти-IIа активности гепарина оптическим методом «ACTICHROME®Heparin (anti-IIa)» (ACTICHROMЕ, Германия).
В качестве интактной матрицы использовалась пулированная нормальная плазма (не содержащая гепарин, собранаот 20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизирована HEPES-цитратным буфером,лиофильно высушенная), а также интактная матрица крови кроликов.В качестве стандартных и калибровочных образов использовали плазмукалибратор для определения анти-Ха активности гепарина (НПО «Ренам», Россия);контрольную плазму для определения анти-Ха активности гепарина (НПО «Ренам», Россия); эноксапарин-натрий стандарт USP RS; пулированная нормальнаяплазма, набор плазм-калибраторов для определения анти-Ха активности гепарина;набор плазм контрольных для определения анти-Ха активности гепарина.
Все вышеуказанные плазмы крови были собраны от 20 доноров в возрасте 20-40 лет, стабилизированы HEPES-цитратным буфером, лиофильно высушены, не содержалигепарина. Кроме того, нами были использованы интактные плазмы крови кроликовкроликов-самцов породы шиншилла массой 2-4 кг.Определение анти-Ха и анти-IIа активности эноксапарина натрия вусловиях in vitroДля определения анти-Ха и анти-IIа активности использовались следующиерастворы реактивов: рабочий буферный раствор, уксусной кислоты 70% раствор,раствор антитромбина III для определения анти-Ха активности, раствор антитромбина III для определения анти-IIа активности, раствор фактора Ха, раствор тром-11бина, раствор хромогенного субстрата для фактора Ха, раствор хромогенного субстрата для тромбина, раствор Рабочего Стандартного Образца НМГ.
HEPESцитратрный буферный раствор рН 7,4 готовили из концентрированного буфера,входящего в состав набора реактивов «Ренапарин-тест», путем разведения 1:20 водой очищенной. Далее готовили серию разведений рабочего стандартного образцаНМГ и серию разведений испытуемого препарата НМГ перед проведением анализа. Определения проводили в полистирольных планшетах, помещая их в термошейкер при 37 оС. Ход анализа определения анти-Ха активности проходил по схеме, представленной в таблицах 1 и 2.Таблица 1.Схема распределения буферного раствора (В), разведения стандартного образцаНМГ гепарина (S1 – S5), образца испытуемого препарата (Т1 – Т4) и референтного препарата (R1-R4) в лунках 96-луночного планшетаРядНомер лунки в ряду1234567891011121BS2S4R1R3T1T32BS2S4R1R3T1T33BS2S4R1R3T1T34BS2S4R1R3T1T35S1S3S5R2R4T2T46S1S3S5R2R4T2T47S1S3S5R2R4T2T48S1S3S5R2R4T2T4-«-» - незадействованная лунка планшетаТаблица 2Порядок внесения реактивов в лунки планшетаРаствор антитромбина III для определения анти-Xa активностиОбразец препарата или стандартаРаствор фактора ХаИнкубация при 37С и перемешивании 2 минРаствор хромогенного субстрата для фактора ХаИнкубация при 37С и перемешивании 4 минУксусная кислота20 мкл20 мкл40 мкл100 мкл40 мклХод анализа определения анти-IIа активности проходил по аналогичной схеме дляфактора IIаТаблица 3Схема распределения буферного раствора (В), разведения стандартного образца НМГгепарина (S2 - S6) , образца испытуемого препарата (Т1 – Т4) и референтного препарата(R1-R4) в лунках 96-луночного планшетаРядНомер лунки в ряду1234567891011121BS3S5R1R3T1T32BS3S5R1R3T1T3-12345678-BBS2S2S2S2S3S3S4S4S4S4S5S5S6S6S6S6R1R1R2R2R2R2R3R3R4R4R4R4T1T1T2T2T2T2T3T3T4T4T4T4----Далее измеряли оптическую плотность растворов при 405 нм с помощьюмикропланшетного ридера Mindray MR-96A.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
