Автореферат (1141344), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Выбор аналитической длины волныбыл обусловлен тем, что при данной длине волны наблюдалось максимальное светопоглощение и специфичность определения, что связано со структурой и цветомпродукта реакции фактора Ха или IIa с хромогенным субстратом (паранитроаналин, максимум поглощения при 405 нм).Определение анти-Ха и анти-IIа активности эноксапарина натрия вусловиях in vivoОпределение антифакторной активности эноксапарина натрия (для оригинального и воспроизведенного препаратов) в условиях in vivo (доклиническое исследование) проходило в два этапа: биологический и аналитический.
На биологическом этапеисследования была сформирована группа экспериментальных животных – кроликовсамцов породы шиншилла, которым случайным образом было распределено применение препарата по таблице рандомизации животных (табл. 4).Таблица 4Животное12345678Схема рандомизации животныхЭтап IЭтап IITRRTTRRTTRRTTRRTПримечание: «Т» – исследуемый препарат, «R» –- референтный препаратВ ходе исследования животные всех экспериментальных групп находились видентичных условиях и подвергались абсолютно одинаковым воздействиям.В соответствии с таблицей рандомизации исследуемые биопрепараты вводили кроликам однократно подкожно в соответствии с СОП «Введение препаратов13экспериментальным животным подкожно», Протоколом по биоэтике, Конвенциейпо работе с позвоночными лабораторными животными и Правилами надлежащейлабораторной практики (GLP).
Время введения исследуемого препарата фиксировалось с точностью до минуты.Забор венозной крови для определения концентрации исследуемых препаратов производили у экспериментальных животных из ушной вены: до введенияпрепаратов, через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 24 ч. Через 7 дней применялся второйпрепарат: T или R, согласно таблице рандомизации, и проводился отбор крови потой же схеме. Объём взятых проб крови для определения эноксапарина составлялоколо 0,5 мл. В ходе всего эксперимента у подопытных кроликов фиксировалимассу и температуру тела, поскольку изменение массы (выход за границы диапазона 2-4 кг) и повышение температуры выше 38,5 оС являлось критерием исключения экспериментальных животных из исследования. Взвешивание и измерениетемпературы производилось еженедельно перед забором крови.
Отбор крови производился в пробирки с цитратом натрия в качестве антикоагулянта. Отобранныепробы крови центрифугировали 20 мин при 3000 об/мин., плазма переносилась вполипропиленовые пробирки, которые плотно укупоривались и помещались в холодильник при 4 °С до передачи их в аналитическую лабораторию. Транспортировка крови в лабораторию осуществлялась с соблюдением температурного режима 4±2 °С. Исследуемую плазму делили на две аликвоты для определения анти-Хаи анти-IIa активности эноксапарина натрия.Пробоподготовка образцов плазмы крови к анализу проводилась путем ихразведения в буферном растворе рН 7,4, приготовленном, как описано ранее на стр.11. Анализ проводили в полистирольном планшете при 37оС.
С помощью одноканального дозатора в две лунки 1-Fи 1-H ряда планшета вносили по 200 мкл рабочего буферного раствора (раствор сравнения). Далее с помощью многоканальногодозатора приготовленные рабочие растворы вносили в полистирольные планшетыпо следующей схеме, представленной в Таблицах 5 и 6.Таблица 5Ход анализаВносили в лунки:Рабочий раствор фактора Xa или IIaОбразец40 мклБланк---14Раствор 2Рабочий буферный растворИнкубировали при 37оС точно 5 минутРаствор хромогенного субстратаИнкубировали при 37оС точно 5 мин70% раствор уксусной кислоты40 мкл-----200 мкл40 мкл---80 мкл--Таблица 6РядABCDEFGHСхема внесения образцов в лунки планшетаНомер лунки в ряду12345678910Контроль 1…. ….
…. …. …. …. …. …. ….Контроль 2…. …. …. …. …. …. …. …. ….Калибровка 0…. …. …. …. …. …. …. …. ….Калибровка 1…. …. …. …. …. …. …. …. ….Калибровка 2…. …. …. …. …. …. …. …. ….Х…. …. …. …. …. …. …. …. ….Х…. …. …. …. …. …. …. …. ….Х…. …. …. …. …. …. …. …. ….11ХХХХХХХХ12БланкБланкХХХХХХХ – пустая лунка«…» – образцы исследуемой плазмы кроликовИзмеряли оптическую плотность образца на планшетном спектрофотометрепри длине волны 405 нм и по калибровочному графику рассчитывали анти-Ха активности эноксапарина натрия.
Аналогичным образом проводили исследованияанти-IIа факторной активности эноксапарина натрия при использовании соответствующих реактивов и раствора фактора свертывания IIа, с целью оценки анти-IIаактивности эноксапарина натрия.Кроме того, разработанная методика была модифицирована для использования на кюветном УФ-спектрофотометре, поскольку объемы исследуемого образца(200 мкл) недостаточно для внесения в классическую кювету шириной 10 см. Дляэтого все объемы вносимых образцов реактивов были пропорционально увеличены в 5 раз по сравнению с методикой для планшетного спектрофотометра, приэтом инкубирование образцов проводилось в пробирках Эппендорфа вместимостью 2 мл в соответствующем термошейкере.Валидация методикиВалидацию методик определения анти-IIа и анти-Ха активности эноксапарина натрия в препаратах и плазме крови кроликов проводили согласно ГФ XIIIОФС "Валидация аналитических методик" по следующим характеристикам: спе-15цифичность, линейность, правильность, прецизионность (на двух уровнях: сходимость, промежуточная прецизионность), аналитическая область.Для методик определения анти-IIа и анти-Ха активности в плазме кровикроликов валидация проводилась как для методики в модификации для планшетного, так и кюветного УФ-спектрофотометра.Специфичность.
Для оценки специфичности методики определения активности анти-IIа и анти-Ха активности эноксапарина натрия в препаратах (in vitro) иплазме крови кроликов (in vivo) для каждой из методик проводили определение активности для холостого образца (для определения анти-IIа и анти-Ха активностиэноксапарина натрия в препаратах в качестве холостого образца использовали водуочищенную). Для определения для анти-IIа и анти-Ха активности эноксапаринанатрия в качестве холостого образца использовали интактную плазму кроликов от6 разных животных, а также интактную плазму крови человека, и рассчитывали вкаждом из случаев сигнал УФ-СФМ для данного образца.Таким образом, было показано, что при использовании разных биологических матриц (плазма крови человека или кроликов) сохраняется специфичностьразработанной методики.Линейность.
Проводили измерение анти-Ха и анти-IIа активности в условиях in vitro и in vivo.Определение анти-Ха активности НМГ in vitro.Готовили 5 образцов стандартных растворов эноксапарина натрия с активностью 0,212 МЕ/мл, 0,141 МЕ/мл, 0,094 МЕ/мл, 0,0628 МЕ/мл, 0,0418 МЕ/мл. Дляпостроения калибровочных кривых использовали линейную регрессию с нормированием 1/x. Проводили линию тренда в диапазоне активности 0,2 – 0,04 МЕ/мл. Пополученным значениям был построен калибровочный график (рисунок 1) совместно с уравнением калибровочной кривой. Коэффициент корреляции составил 0,98для этого и последующих определений.
Во всех случаях была отмечена обратнаяпропорциональная зависимость активности эноксапарина натрия от оптическойплотности образца.16Рис. 1. Калибровочный график для определения анти-Хa активности препарата.Определение анти-IIа активности НМГ, in vitro. Проводили измерение оптической плотности 5 образцов стандартных растворов эноксапарина натрия с активностью 0,041 МЕ/мл, 0,0277 МЕ/мл, 0,0184 МЕ/мл, 0,0123 МЕ/мл, 0,0082МЕ/мл.Рис. 2. Калибровочный график для определения анти-IIa активности препаратаОпределение анти-Ха активности НМГ, in vivo.
Проводили измерение оптической плотности 3 стандартных растворов эноксапарина натрия с активностью0,00 МЕ/мл, 0,48 МЕ/мл, 0,93 МЕ/мл.Рис. 3 Калибровочный график зависимости оптической плотности эноксапарина отего активности (анти-Ха).Определение анти-IIа активности НМГ, in vivo. Проводили измерение оптической плотности 4 образцов стандартных растворов эноксапарина натрия с активностью 0,000 МЕ/мл, 0,0150 МЕ/мл, 0,300 МЕ/мл, 0,600 МЕ/мл.17Рис. 4. Калибровочный график зависимости оптической плотности эноксапарина отего активности (анти-IIа).Правильность и прецизионность. Определение анти-Ха и анти-IIа активностиНМГ in vitro. Проводили анализ 3 образцов активности стандартных растворовэноксапарана натрия 0,212 МЕ/мл, 0,0940 МЕ/мл, 0,0418 МЕ/мл для определенияанти-Ха и 0,0410 МЕ/мл, 0,0184 МЕ/мл, 0,0082 МЕ/мл для определения анти-IIаактивностей.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
