Диссертация (1141308), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Получение водного извлечения и хроматографическое исследованиепроводили по выше приведенным методикам (глава 2, п. 2.3.3).Результаты хроматографического анализа исследуемого водного извлечениясбора представлены на рис. 3.5.3.2.4 и в табл. 3.5.3.2.5.119Рис. 3.5.3.2.4 ВЭЖХ-хроматограмма свободных сахаров и органических кислотводного извлечения изучаемого сбораТаблица 3.5.3.2.5Компонентный состав свободных сахаров и органических кислот изучаемогосбора методом ВЭЖХ№1.2.3.4.5.6.7.Время,мин4,2215,2946,4126,9878,68412,1514,44Высота,mV132,6458,9743,7654,40300,0313,6819,76Площадь,mV*сек6138,852992,951294,901759,0921298,00950,582857,88НазваниеЩавелевая к-таНеидентифиц.ФруктозаГлюкозаЯнтарная к-таНеидентифиц.Неидентифиц.Таким образом, проведенный анализ показал, что в водном извлеченииизучаемого сбора идентифицированы органические кислоты (янтарная – 57,11%,щавелевая – 16,46%) и свободные сахара (фруктоза – 3,47%, глюкоза – 4,72%), чтоподтверждает и дополняет полученные результаты метода тонкослойнойхроматографии.1203.5.3.3 Идентификация компонентов эфирного масла методомгазожидкостной хроматографииС целью изучения качественного состава эфирного масла изучаемого сбораметодом ГЖХ было получено эфирное масло методом перегонки с водяным паром(глава 2, п.
2.3.2). Более подробно условия анализа представлены в работе [119].Спиртовой раствор эфирного масла сбора и растворы стандартных образцовкомпонентов эфирного масла хроматографировали по выше приведенной методике(глава 2, п. 2.3.2).Результаты проведенного исследования представлены на рис. 3.5.3.3.1 и втабл. 3.5.3.3.2.Рис. 3.5.3.3.1 ГЖХ-хроматограмма спиртового раствора эфирного маслаизучаемого сбора121Таблица 3.5.3.3.2Компонентный состав эфирного масла изучаемого сбора методом ГЖХ№1.2.3.4.5.НаименованиеЛимоненКамфораГераниолАнетолБорнилацетатВремя, мин3,015,075,215,866,63Содержание, %1,746,882,4786,132,79Таким образом, нами в результате проведенного исследования былиидентифицированы компоненты эфирного масла, полученного из сбора:монотерпеноиды (лимонен – 1,74%, камфора – 6,88%, гераниол – 2,47%);фенилпропаноид (анетол – 86,13%); сложный эфир (борнилацетат – 2,79%) [119].3.6 Разработка методики количественного определения суммы флавоноидовв изучаемом сбореДля определения флавоноидов широко используемым является методдифференциальнойспектрофотометрии,основанныйнареакциикомплексообразования с алюминием хлоридом (III), в результате которойпроисходит батохромный сдвиг полос поглощения флавоноидов.
Также, этотметод является пригодным для анализа и стандартизации сборов [99]. Болееподробно условия анализа представлены в работе [115].В качестве СО был выбран лютеолин-7-гликозид, который с алюминиемхлоридом (III) имеет аналогичную кривую и близкий максимум поглощения водной области 402±5 нм с максимумом поглощения флавоноидов сбора с тем жекомплексообразователем (рис. 3.6.1.1).122(1)(2)Рис. 3.6.1.1 Спектры поглощения комплексов флавоноидов изучаемого сбора (1) иСО лютеолин-7-гликозида с алюминием хлорида (2)Для выбора оптимальных условий экстракции суммы флавоноидов изразработанного сбора изучено влияние ряда параметров: характер экстрагента,измельченность сырья, соотношение сырья и экстрагента, время и кратностьэкстракции.Экстракциюпроводилинакипящейводянойбанесобратнымхолодильником из навески сбора массой 5,0 г.В табл.
3.6.1.2 приведены средние значения из пяти определений.Таблица 3.6.1.2Содержание суммы флавоноидов в извлечениях изучаемого сбора взависимости от условий экстракцииУсловия экстракции1Концентрация спирта, %40% спирт50% спирт60% спирт70 % спирт80% спирт96% спиртСодержание суммы флавоноидов впересчете на лютеолин-7-гликозид, %20,33±0,010,41±0,010,43±0,020,47±0,020,46±0,010,34±0,01123Продолжение таблицы 3.6.1.21Измельченность сбора, мм0,51235Соотношение сырья: экстрагента1:51:101:151:20Время экстракции, мин1530607590Кратность экстракцииоднократнаядвухкратнаятрехкратная20,39±0,010,41±0,010,46±0,020,42±0,020,41±0,010,42±0,010,48±0,020,45±0,010,43±0,010,38±0,010,41±0,010,47±0,020,45±0,010,43±0,010,39±0,010,46±0,010,44±0,01Полученные результаты свидетельствуют о том, что оптимальнымиусловиями анализа являются: экстрагент – 70% спирт, соотношение сырья иэкстрагента – 1:10, измельченность сбора – 2 мм, двухкратная экстракция по 60минут [115].Экспериментально установленные оптимальные условия экстракции легли воснову методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете налютеолин-7-гликозид в изучаемом сборе и приведены в описании методики.Методика.
Пробу сырья (анализируемый сбор) измельчают до величинычастиц, проходящих сквозь сито с отверстиями размером 2 мм. Далее отвешиваютточную навеску сбора массой 10,0 г, помещают в колбу (объемом 200 мл),добавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу с навеской в спиртоводной смесисоединяют с обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане смомента закипания в течение 1 ч. После охлаждения для отделения частиц сырья124от полученной вытяжки проводят фильтрование через фильтровальную бумагу вмерную колбу (объемом 100 мл). Экстракцию повторяют с 50 мл 70% этиловогоспирта в течение 1 ч. После охлаждения спиртоводной вытяжки фильтруют в ту жемерную колбу, полученный объём доводят до метки соответствующимрастворителем – 70% этиловым спиртом (раствор А).В мерную колбу (объемом 25 мл) отмеряют 1,0 мл раствора А, добавляют 2мл 2% раствора алюминия хлорида (III) и полученный объем доводят до метки 70%этиловым спиртом [115].Раствор сравнения: в мерную колбу (объемом 25 мл) отмеряют 1 мл раствораА, добавляют 0,1 мл разведенной уксусной кислоты и доводят до метки – 95%этиловым спиртом (раствор должен быть свежеприготовленным).Оптическуюплотностьполученныхрастворовизмеряютнасаморегистрирующем спектрофотометре «Helios Alfa» (Spectronic Unicam,Великобритания) через 40 минут при длине волны 402±5 нм в кювете с толщинойслоя 10 мм.Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО лютеолин-7гликозида (при длине волны 402±5 нм): 1,0 мл СО лютеолин-7-гликозида отмеряютв колбу (объемом 25 мл), добавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида (III),полученный объем доводят до метки 70% этиловым спиртом.
В качестве растворасравнения используют раствор, содержащий 1,0 мл СО лютеолин-7-гликозида, 0,1мл разведенной уксусной кислоты и 95% этиловый спирт до 25 мл.Содержание суммы флавоноидов в анализируемом сборе в пересчете налютеолин-7-гликозид и абсолютно сухое сырьё в процентах (Х) вычисляют поформуле (1):D*× 100 × 25 × М × 1× 100 × 100Х=D × М* × 100 × 1 × 25 × (100 – W)гдеD* – оптическая плотность испытуемого раствора;D – оптическая плотность СО лютеолин-7-гликозида;(1)125М* – масса навески анализируемого сбора, г;М – масса СО лютеолин-7-гликозида, г;W – потеря массы при высушивании изучаемого сбора, %.Приготовление раствора стандартного образца лютеолин-7-гликозида:точную навеску СО лютеолин-7-гликозида (массой 0,03 г) помещают в мернуюколбу (объемом 100 мл), растворяют в 50 мл 70% этанола и доводят тем жерастворителем до метки – 70% этиловым спиртом, перемешивают [115].3.6.1 Валидация методики количественного определения суммы флавоноидовв изучаемом сбореНа следующем этапе была проведена валидационная оценка разработаннойметодикипокритериям:правильность,прецизионность(сходимостьивоспроизводимость), специфичность, линейность [6, 5, 25, 28, 184, 188].Правильность методики устанавливали путем проверки метода намодельных растворах СО лютеолин-7-гликозида.
Модельные растворы готовилитрёх концентраций с содержанием лютеолин-7-гликозида в % к исходнойконцентрации 80%, 100%, 120%. Исходная концентрация лютеолин-7-гликозидасоставляла 0,4 мг в 25 мл. Определение проводилось в трёх повторностях длякаждойконцентрации.Кpитepиемпpиeмлeмocтиявлялсясредний%восстановления при использовании растворов концентраций 80%, 100%, 120%,скорректированный на 100% и его средняя величина должна находиться в пределах98,0-102,0%.Согласно нашим результатам % восстановления находился в пределах от99,49% до 101,99% и его средняя величина составила – 99,93% (табл. 3.6.1.1).126Таблица 3.6.1.1Результаты проверки правильности методики№1.1.11.21.3среднее2.2.12.22.3среднее3.3.13.23.3среднееСредний процентвосстановления для 3-хконцентраций в трёхповторностяхРеальное значениеизмеряемойвеличины вмодельной смеси вмг0,32Экспериментально найденное значениеАбсолютнаявеличина, мгПроцентвосстановления, %0,3230,3190,316100,999,5798,7799,750,3940,4020,40898,49100,43101,99100,30,4850,4750,401101,0298,9100,2999,7499,930,40,48Определение сходимости проводили в разные дни с использованиемспектрофотометра «Helios Alfa» (Spectronic Unicam, Великобритания) одним и темже специалистом на одном образце изучаемого сбора в 6 повторностях ссодержанием суммы флавоноидов в пересчёте на лютеолин-7-гликозид 0,43%.Оценка сходимости проводилась по коэффициенту вариации (CV).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
