Автореферат (1141251), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Из существующих насегодняшний день методов пробоподготвки при проведении исследованийметодом ВЭЖХ, а именно: жидкость-жидкостная экстракция, твердофазнаяэкстракция, осаждение белков для анализа тиозонида был выбран методосаждения белков. Данный метод прост, быстр и экономичен.
Выбор методаВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектором для количественного определениятиозонида в плазме крови обусловлен рядом существенных преимуществ данногометода: возможность анализа широкого спектра соединений даже в минорныхконцентрациях,чтопозволяетпроводитьдетектированиесвысокойчувствительностью и селективностью; малый объем биоматериала, требуемыйдля анализа.Дляанализатиозонидабылиподобраныследующиеусловияхроматографирования:Подвижная фаза: 0,1 % раствор муравьиной кислоты в воде/ацетонитрил (40:60),предварительно дегазированная;Скорость потока подвижной фазы: 1,1 мл/мин;Неподвижная фаза: хроматографическая колонка Agilent Eclipce XDB-C184.6x50 мм; 1,8 мкм, при температуре 30 оС;Объем вводимой пробы: 10 мкл;Время удерживания: около 2,0 минут;13Детектирование: масс-спектрометрический детектор, тип ионизации: ESI; режимсканирования: режим индивидуальных масс (SIM) по положительному иону m/z= 561,1 (тиозонид); высушивающий газ – азот: скорость потока и температураосушающего газа 12 л/мин и 250°С, соответственно; напряжение на капилляре4000 В, напряжение на фрагменторе 70 В;Общее время хроматографирования: 4 мин.Время удерживания тиозонида составило около 2,0 минут.
Хроматограммаобразцаплазмы,содержащейрастворстандартногообразцатиозонидапредставлена на Рисунке 2.Рисунок 2. Хроматограмма образца плазмы, содержащей раствор стандартногообразца тиозонида.Валидация методики количественного определения тиозонида в плазме кровичеловекаВалидацию методики проводили, ориентируясь на требования «Руководствапо экспертизе лекарственных средств» под редакцией профессора А.Н.
МироноваТом I, а также на основании руководств по валидации биоаналитических методикFood and Drug Administration (FDA) и European Medicines Agency (EMA) последующим характеристикам: селективность; линейность; правильность (науровнях inter-day и intra-day); прецизионность (на уровнях inter-day и intra-day);предел количественного определения; стабильность растворов; перенос пробы.14СелективностьДля определения селективности проводили анализ 6 образцов чистойплазмы, образца чистой плазмы с прибавлением стандартного раствора тиозонидав диапазоне концентраций 1нг/мл – 1000 нг/мл.
На хроматограммах образцовчистойплазмыненаблюдалосьпиковсовременемудерживания,соответствующим времени удерживания тиозонида. Разрешение между пикомбланка и пиком анализируемого соединения имеет величину 3,149, чтосоответствует нормам, критерий пригодности – разрешение не менее 3.ЛинейностьДля определения линейности проводили анализ 9 образцов чистой плазмы сприбавлениемрастворастандартногообразцатиозонидадополученияконцентраций: 1 нг/мл, 5 нг/мл, 10 нг/мл, 25 нг/мл, 50 нг/мл, 100 нг/мл, 250 нг/мл,500 нг/мл и 1000 нг/мл.
Каждая модельная смесь анализировалась 3 раза. Пополученным значениям был построен калибровочный график совместно суравнением калибровочной кривой (y = 0,0034030x - 2,745), приведены наРисунке 3.Рисунок 3. Калибровочный график зависимости площади пика тиозонида от егоконцентрации в плазме (нг/мл).15Критериями приемлемости являются как коэффициент корреляции (R2 >0,998), так и свободный член a в уравнении полученной прямой, который недолжен превышать 5% от площади пика в модельной смеси с ожидаемойконцентрацией. В данном случае как видно по полученному уравнениюкалибровочной кривой y = 0,0034030x - 2,745 свободный член имеет величину помодулю 2,745 и не превышает 5% от площади пика аналита с концентрацией 1нг/мл.
Величина площади пика тиозонида для модельной смеси с концентрацией1 нг/мл в среднем составила 1178.Отклоненияконцентрацийкалибровочныхрастворовтиозонида,рассчитанных по уравнению линейной зависимости, от фактических значенийприведены в Таблице 1.Таблица 1Отклонения концентраций калибровочных растворов тиозонида от фактическихзначенийC фактическая,нг/мл151025501002505001000С рассчитанная,нг/мл0,864,509,0423,4247,2999,93238,04539,55988,47ε, %Норма-14,01-10,10-9,65-6,32-5,41-0,07-4,795,91-1,15Не более 20%Не более 15%Полученные отклонения соответствуют нормам FDA и EMA (не более 20 % длянижнего диапазона линейности, не более 15 % - для остальных точек).Правильность и прецизионностьПроводили анализ 4 образцов чистой плазмы с прибавлением стандартногораствора тиозонида до получения концентраций: 1 нг/мл, 10 нг/мл, 100 нг/мл,1000 нг/мл. Каждый раствор хроматографировали 5 раз.
Исследование проводилив течение 1-го дня (intra - day) и 2-го дня (inter-day). Для полученных значенийконцентрацийбылирассчитанывеличины16относительногостандартногоотклонения (RSD, %) и относительной погрешности (ε, %), которые приведены вТаблицах 2 и 3.Таблица 2Правильность и прецизионность методики (intra-day)Введено (нг/мл)Найдено (нг/мл), n=5RSD, % (n=5)ε, %11,1260,09112,6010100100010,496101,131005,50,0430,0332,5004,961,130,555Таблица 3Правильность и прецизионность методики (inter-day)Введено (нг/мл)Найдено (нг/мл), n=5RSD, % (n=5)ε, %11010010001,02710,525100,3261002,11616,12510,2235,7412,0262,7005,2500,3260,212Полученные величины относительного стандартного отклонения (RSD, %) иотносительной погрешности (ε, %) соответствуют нормам FDA и EMA (не более20 % для минимальной концентрации, не более 15 % - для остальныхконцентраций).Предел количественного определенияПредел количественного определения (ПКО) методики определяли наосновании данных линейности, правильности и прецизионности.
За ПКОметодики принималась минимальная концентрация тиозонида в плазме, длякоторой возможно определение тиозонида со значениями RSD и ε не более 20 % вдиапазоне линейной зависимости. Предел количественного определения методикисоставил1нг/мл.Величинасоотношениясигнал/шумсоставилаХроматограмма, демонстрирующая ПКО методики, приведена на Рисунке 4.1710:1.Рисунок 4.
Хроматограмма плазмы, содержащей тиозонид на уровне ПКО.СтабильностьСтабильность была подтверждена для стандартных растворов тиозонида(при хранении раствора в течение 14 дней при температуре от 2 до 8 оС),кратковременная стабильность (для приготовленных проб в течение 24 и 48 часовпри анализе на следующий день при температуре 15 оС) на уровнях концентраций1 и 1000 нг/мл. Образцы выдерживали 3 цикла заморозки-разморозки. Площадьпика при повторных анализах не менялась более чем на 10 %.Для исследования долговременной стабильности образцы плазмы на уровнеконцентрации 100 нг/мл помещены в морозильную камеру при температуре отминус 75 до минус 80 оС для последующего анализа спустя 1 месяц послезаморозки.
Площадь пика при повторных анализах не менялась более чем на 10%.Перенос пробыПри последовательном вводе пробы с концентрацией тиозонида 100 нг/мл ичистойплазмынахроматограммечистойплазмысоответствующие тиозониду. Перенос пробы отсутствовал.18отсутствовалипики,Применение разработанной методики для исследования фармакокинентикиоригинального противотуберкулёзного препарата ТиозонидРазработанная методика количественного определения тиозонида в плазмекрови человека была применена в клиническом исследовании фармакокинетикипрепарата Тиозонид при однократном пероральном приеме возрастающих дозразличными группами здоровых добровольцев.Входеисследованиябылиполученыиндивидуальныезначенияконцентраций тиозонида в плазме крови во времени, а также рассчитаныиндивидуальные и усредненные фармакокинетические профили тиозонида.УсредненныефармакокинетическиепрофилипрепаратаТиозонидпослеоднократного перорального приема 25 мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг приведены наРисунке 5.Рисунок 5.
Усредненные фармакокинетические профили тиозонида (послеоднократного перорального приема 25 мг, 200 мг, 400 мг, 600 мг).Для каждого добровольца были рассчитаны основные фармакокинетическиепараметры: значения площади под кривыми «концентрация-время» (AUC0-t),максимальная концентрация в плазме (Сmax), время достижения максимальнойконцентрации (Tmax), общая площадь под кривой AUC0-∞, период полувыведения(Т½), константа элиминации (kel). Проведен статистический анализ результатов.Усредненные значения фармакокинетических параметров Тиозонида послеприема препарата приведены в Таблице 4.19Таблица 4.Усредненные значения фармакокинетических параметров Тиозонида послеприема препаратаCmax,нг/млTmax,чMean69,55SDCV, %14,621124MeanSDCV, %521,9180,6356234MeanSDCV, %892,3251,928600MeanSDCV, %1359,3370,327600AUC(0-168),нг*ч/мл25 мгkel, чAUC(0-∞),нг*ч/млT 1/2,ч12670,03112672450940200 мг10508405239400 мг16760329420600 мг252313580140,00928509407270,0270,0051710957391136264160,0300,0041516847331020245200,0300,005162552034471424521-1Как видно из представленных данных Сmax тиозонида составила 70 ± 8нг/мл; 522 ± 94 нг/мл; 892 ± 131 нг/мл; 1359 ± 193 нг/мл для дозировок 25 мг, 200мг, 400 мг и 600 мг, соответственно.
Фармакокинетика в диапазоне доз 25 мг –600 мг является линейной по параметру Сmax. (R2 > 0,99, значимость критерияФишера имеет величину 0,002 << 0,05), график линейности приведен на рисунке6.Рисунок 6. Линейность фармакокинетики тиозонида по параметру Cmax.20AUC0-168 тиозонида составила 1267 ± 265 нг*ч/мл; 10508 ± 2108 нг*ч/мл;16760 ± 1713 нг*ч/мл; 25231 ± 1862 нг*ч/мл для дозировок 25 мг, 200 мг, 400 мг и600 мг, соответственно. Фармакокинетика в диапазоне доз 25 мг – 600 мг являетсялинейной по AUC0-168 (R2 > 0,99, значимость критерия Фишера имеет величину0,004 << 0,05) , график линейности приведен на рисунке 7.Рисунок 7.
Линейность фармакокинетики тиозонида по параметру AUC.Тиозонид постепенно всасывался в системный кровоток при пероральномприеме (Tmax около 6 ч) и медленно выводился из плазмы крови.Для количественной оценки скорости выведения препарата из организмарассчитывали константу элиминации (kel) в соответствии с кинетическимуравнением 1-го порядка, принимая во внимание весь нисходящий участокфармакокинетической кривой с ненулевыми значениями. Период полувыведениятиозонида составил около 25 ч.
Тиозонид практически не обнаруживался в плазмекрови спустя 168 ч после однократного применения для дозировки 25 мг, либообнаруживался на низких уровнях для дозировок 200, 400, 600 мг.ОБЩИЕ ВЫВОДЫ1. Проведенаналитическийобзорсовременнойнаучной,нормативной,методической литературы по изучению чувствительных и специфичныханалитических методов, применяемых при изучении фармакокинетикилекарственных средств.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
