Диссертация (1140952), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Например, в локусе 13q34 расположены геныколлагена IV типа COL4A1 и COL4A2, а также гены факторов свертыванияFVII и FX, также в локусе 7q22.1 расположены ген SERPINE1, кодирующийбелок PAI-1, и ген COL1A2, кодирующий α2-цепь коллагена 1 типа. [135; 136;137; 138; 139]Белок PAI-1 имеет двоякую функцию: помимо своей основной функции –ингибирования процессов фибринолиза, – он также играет важную роль впроцессах интерстициального фиброза [99; 140; 141].Белок ADAMTS13 также играет важную роль как в заболеваниях,сопровождающихся дезорганизацией соединительной ткани, так и в процессахгемокоагуляции,посколькуонрасщепляетмолекулуфакторафонВиллебранда в положении tyr1605-met1606, тем самым снижая его активность,43при этом снижение активности ADAMTS13 нередко проявляется притромботической тромбоцитопенической пурпуре [142; 143; 144].На данный момент не изучены морфологические и молекулярногенетические особенности эндометрия у женщин с сочетанием НТ+нДСТ,не проведен сравнительный анализ морфологических и молекулярногенетических особенностей эндометрия у женщин с сочетанием НТ инДСТ, а также у женщин с НТ, нДСТ и здоровыми женщинами.
Такженедостаточно глубоко изучен морфогенез очагов склероза у пациенток сНТ и сочетанием НТ+нДСТ.44Глава 2. Материал и методы исследования.2.1. Материал исследованияБыло проведено проспективное исследование «случай-контроль».Исследование выполнено на материале пайпель-биоптатов эндометрия,взятых на 6-8 день после овуляции по данным УЗИ от 200 пациенток,находившихся на обследовании и лечении по поводу первичного бесплодия вФГБУ НЦАГиП им. акад.
В.И. Кулакова (директор – академик РАМН,профессор Сухих Г.Т.) и ООО "Гематологический кабинет доктора ДимитрияКолосовского" (руководитель – Колосовский Д.Ю.), а также женщин,обращавшихся в ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова по поводусуррогатного материнства.Критерии включения в 1-3 группы: репродуктивный возраст, бесплодие ванамнезе, наличие диагноза нДСТ, наличие диагноза НТ либо сочетания этихзаболеваний. Критерии исключения: наличие гиперплазии эндометрия,полипа эндометрия, хронического эндометрита, наличие расстройствменструальной функции любого генеза, наличие тяжелой сопутствующейпатологии (ревматические болезни, онкологические заболевания, сахарныйдиабет).Критериивключениявгруппуконтроля(группу№4):репродуктивный возраст, отсутствие заболеваний, так или иначе влияющих нарепродуктивную функцию.По результатам осмотра, тщательного сбора анамнеза, проведенияобщеклинического и генетического исследования на основании критериеввключения и исключения была отобрана 81 пациентка, которые былиразделены на 4 группы.
В 1 группу вошло 13 пациенток с клиническимдиагнозом нДСТ (средний возраст 31,9±4,5 лет), во 2 группу – 40 пациенток склиническим диагнозом НТ (средний возраст 32,6±4,8 лет), в 3 группу – 19пациенток с сочетанием клинических диагнозов НТ+нДСТ (средний возраст32.3±4,7 лет), в 4 группу – 9 пациенток, группа контроля – здоровыесуррогатные матери (средний возраст 29±5,2 года) (рис.
2.1).45Рис.2.1. Дизайн исследованияМорфологическое исследование проводилось на кафедре патологическойанатомии им. акад. А.И. Струкова ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им И.М.Сеченова»(заведующаякафедрой–профессорКоганЕ.А.)ивпатологоанатомическом отделении ФГБУ НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова(руководитель отделения – профессор Щеголев А.И.).2.2. Методы исследования.2.2.1 Исследование клинических данных.Исследовались выписки из медицинских карт пациенток, включавшие всебя следующие данные: паспортные данные, жалобы, анамнестическиеданные. Анамнестические данные включали в себя наследственность (до 3колена), информацию о менструальной функции (время менархе, длина цикла.длительность и регулярность менструаций), репродуктивной функции(количество беременностей в целом, замерших беременностей, родов,медицинскихабортов,выкидышейво2триместре,внематочныхбеременностей в анамнезе), проведенных ранее циклах IVF – ЭКО и ИКСИ(общее число протоколов, число неудачных протоколов, исход каждогоудачного протокола), данные физикального исследования, результатыисследования системы гемостаза (уровни PAI-1 и гомоцистеина в сыворотке46крови,результатыметиониновоготеста,результатыгенетическогоисследования – полиморфизм или мутации следующих генов: FII, FV (Leiden),FVII, FXII, FXIII, GpIa, GpIb (-5), GpIb (T145M), GpIIIa, PAI-1, FBGb, MTHFR,MTRR, MTR, SLC19A1, ангиотензиногена (M235T и Т145М), ангиотензинпревращающего фермента, их гомо- или гетерозиготность).РезультатыпредоставленыгенетическогоОООисследования"ГематологическийкаждойкабинетизпациентокдоктораДимитрияКолосовского" и лично руководителем организации Колосовским Д.Ю.Диагноз НТ ставился при выявлении мутаций в исследуемых генах всоответствии с клиническими рекомендациями Американской коллегииторакальных врачей по антитромботической и тромболитической терапии [27;28].БальнуюоценкувыраженностисимптомовнДСТпроводиливсоответствии с руководством Т.И.Кадуриной [126] ввиду более подробнойразбалловки признаков по сравнению с работой Т.Ю.Смольновой [127].
Крометого, в работе Т.Ю.Смольновой не указано, сколько минимально балловнеобходимо для постановки диагноза нДСТ, а также не учтены изменениясердца и крупных сосудов. Поскольку в руководстве Т.И.Кадуриной приведенширокий спектр инструментальных и лабораторных показателей, многие изкоторых невозможно выявить в рамках обычного физикального исследования,то сумма баллов, необходимая для постановки диагноза нДСТ, была сниженадо 7 баллов.Данные о каждой пациентке заносились в таблицу, сделанную вредакторе Microsoft Excel, для дальнейшей обработки.2.2.2.
Морфологические методы исследованияОт каждой пациентки, отобранной в исследование, использовалисьпайпель-биоптаты эндометрия, взятые в период «окна имплантации» (6-8 деньпосле овуляции по данным УЗИ).Материал, полученный от пациенток, фиксировался в 10% нейтральномформалине с фосфатным буфером, обрабатывался в аппарате гистологической47проводки тканей фирмы «Pool Scientific Instruments» (Швейцария) и заливалсяв парафин. Суммарное время фиксации, проводки и заливки материала, какправило, не превышало 48 часов.
Затем с каждого блока готовилось 25ступенчатых парафиновых срезов толщиной 4–5 мкм, которые фиксировалина предметные полилизиновые стекла (Mаinzel Glаser, Polylisine, Германия) иинкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 12 часов. Далеесрезы депарафинировали и регидратировали последовательно в рядерастворов, состоящем из 3-х ксилолов, 2-х абсолютных спиртов, 2-х 95%спиртов, 80% и 70% спирта и дистилированной воды.
По препарату от каждогослучая окрашивали гематоксилином и эозином. Также препараты окрашивалитолуидиновым синим, пикрофуксином по Ван Гизону по общепринятойметодике.2.2.3. Морфометрические методы исследования.Морфометрическое исследование проводили с помощью микроскопаZeiss Axioplan imaging2, оборудованного фотокамерой Zeiss AxioCam Hrc ипрограммногообеспеченияAxioVisionv.4.6.2.Морфометрическоеисследование проводили в несколько этапов.
1. Каждый биоптат представляетсобойсрезнекоторогоколичествакусочковэндометрия,которыерасположены в определенном порядке друг относительно друга, и ихрасположение в серийных срезах меняется незначительно. Поэтому длякаждого случая (серии срезов) на отдельном листе бумаги была нарисованасхемарасположениякусочковвпрепарате,каждыйкусочекбылпронумерован (рис. 2.2, в). 2.
Проводилась фотосъемка каждого из кусочковна наиболее удобном для этого увеличении (самые крупные кусочки – наувеличении х25, самые мелкие – на х400), с помощью ПО AxioVision v.4.6.2оценивалась площадь этого кусочка: кусочек обводился в программе, апрограмма автоматически (для каждого увеличения был стандартизованныймасштаб) подсчитывала его площадь в квадратных микронах. При этомкусочком, который должен был подвергнуться оценке площади, считалсяфрагмент эндометрия, содержащий как строму, так и железистый эпителий;48Рис.2.2. Протокол морфометрического исследования. I – лицевая сторона, II – оборотнаясторона.
а – фамилия пациентки, б – группа пациентки, в – схема расположениякусочков в препарате, каждому кусочку присвоен номер, г – площадь очагов склероза,выявленных в соответствующих кусочках; записано по схеме <номер кусочка><увеличение, на котором производилось измерение>-<площадь очага склероза в мкм2>,д – выявленные площади экспрессии коллагенов 1 и 3 типов в очагах склероза, ихсумма, е – расчеты, ж – площадь кусочков эндометрия, записано по схеме, аналогичнойв п. г, з – условные линии, необходимые для измерения площади больших кусочков49скопления исключительно желез, без стромы, не учитывались, равно каки фрагменты стромы, лишенные желез. Если кусочек был настолько большим,что не попадал целиком в поле зрения даже на увеличении х25, то он условноделился на 2 или 3 части воображаемыми прямыми линиями (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
