Автореферат (1139718), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Общие показатели качества исследуемых МЭ определяли по методикам ОФС ГФ РФXIII изд., ЕФ и ГОСТов, регламентирующих качество пищевых РМ. Определение перекисногочисло (ПЧ) - ГОСТ Р 51487-99, ГФ РФ XIII изд. и ЕФ; йодного число (ЙЧ) - ГОСТ Р 5475-69 и ГФ РФXIII изд.; кислотного числа (КЧ) - ГОСТ Р 50457-92 и ГФ РФ XIII изд.; числа омыления (ЧО) – ГФРФ XIII изд. и ЕФ; эфирное число (ЭЧ) определяли по разности между ЧО и КЧ; показателяпреломления (ПП) - ГОСТ Р 5482-90; цветного числа (ЦЧ) - ГОСТ 5477-93; анизидинового числа (АЧ) ГОСТ Р 5482-90; тиобарбитурового числа (ТБЧ) - ГОСТ Р 5482-90. Определение степени чистотыМЭ проводили по методикам: (парафина, воска, смоляных кислот - ОФС ГФ РФ ХIII изд; мыла - ГФ РФ ХIIIизд.
и ГОСТ 5480-59 для масел, не предназначенных для приготовления инъекционных растворов;содержания влаги и летучих веществ проводили согласно методике ГОСТ Р 50456-92 пометоду В для РМ с КЧ менее 4; воды и белков – ОФС ГФ РФ ХIII изд; общую зольность МЭ ГОСТ 5474-66).Определение БАВ в МЭ проводили по методикам: сумма каротиноидов - ФС 4210179-99, 42-3873-99; массовая доля витаминов А и Е - ГОСТ 30417-96; неомыляемые вещества ГОСТ 5479-64; фосфорорганические соединения - ГОСТ Р 52676; состав жирных кислот - ГОСТ31663-2012 и 31665-2012.В качестве стандартных образцов использовались коммерчески доступныеиндивидуальные вещества: α-токоферол (ICN «Biomedical», США, ≥ 97 %), рутин(≥94%, Sigma), гиперозид (≥95%, HWIANALYTIKGMBH), изокверцитрин (≥94%,HWIANALYTIKGMBH),кемпферол-3-глюкозид(≥95%,PhytoLab),хлорогеноваякислота (≥95%, Sigma), кофейная кислота (≥98%, Sigma), феруловая кислота (≥99%,Aldrich), розмариновая кислота (>96%, Aldrich), кафтаровая кислота (≥98%, Fluka), пкумаровая кислота (≥98%, Sigma), синаповая кислота (≥98%, Sigma), ретинола ацетат(ФС 42-7811-97), эргокальциферол (ФСП 42-0008018000), β-каротин (ВФС 420008018000), танин, галловая кислота, кверцетин, простые сахара (рамноза, глюкоза,ксилоза, фруктоза), органические кислоты (аскорбиновая, винная, щавелевая, лимонная,яблочная, янтарная), аминокислоты (пролин, глицин, глутаминовая кислота, метионин,фенилаланин, аргинин, валин, лейцин) (≥98%, ЗАО «Вектон», СПб, Россия).
В работеиспользовали реактивы и растворители марки х.ч. и ч.д.а. (ЗАО «Вектон», СПб, Россия),отвечающие требованиям соответствующей НД.Разработанные методики валидировали согласно ОФС ГФ РФ XIII изд.«Валидация фармакопейных методик». Статистическую обработку экспериментальных17данных проводили фармакопейным методом по ОФС «Статистическая обработкарезультатов химического эксперимента») и с помощью программы «Statistica - 7.0».Результаты исследования1. Разработка методологических подходов к определению основных групп БАВЛРС и МЭ методом ВЭТСХИзучение возможности теоретического подхода к выбору оптимальных условийхроматографирования различных групп БАВ, позволяющих провести их разделение,идентификацию и количественное определение методом ТСХ является актуальным имало разработанным направлением хроматографии в целом.
Для исследованиязакономерностей хроматографического поведения в тонком слое представителейосновных классов БАВ, присутствующих в ЛРС, было изучено значение основногофактора, влияющего на параметры эффективности хроматографического процесса:полярности элюента (Р). В эксперименте для исследуемых БАВ изучено более двадцатитипов элюирующих систем в широком диапазоне полярности и установленызависимости величины Rf от полярности системы. При детальном исследовании влиянияполярности системы на величину Rf, для каждого отдельного БАВ был определенинтервал значений полярности элюента, в котором наблюдалась линейная зависимость(табл. 1).Таблица 1 - Параметры установленных линейных зависимостей величины Rf БАВ от Р системы(где y= Rf, а х=Р)УравнениеДиапазон Р системы для№Диапазон2БАВRлинейнойполучения оптимальныхп/плинейностизависимостивеличин RfБАВ ЛРС и МЭ липофильной природы1β-каротин0-2,00,9756 у=2,5383x+0,17290,05 - 0,172 Эргокальциферол 0,58 - 1,10 0,9701 у=1,0455x-0,51000,77 - 1,063Ретинола ацетат 0,73 - 1,10 0,9907 у=0,3880x-0,08470,20 - 1,104α-токоферол0,40 - 1,10 0,9830 у=0,9647x-0,29760,62 - 0,93БАВ ЛРС гидрофильной природы5Рутин4,90 – 6,30 0,9740 у=0,4762x-2,10955,06 – 5,69Аскорбиновая64,0 - 4,700,9850 у=0,7524x-3,01274,40 - 4,80кислота7Аргинин3,90 – 8,01 0,9545 y=0,1293x–0,54086,50 – 8,828Глицин3,90 – 5,54 0,9243 y=0,3074x–1,20724,90 – 5,88Глутаминовая95,13 – 6,00 0,9615 y=0,6191x–2,79415,00 – 5,48кислота10Валин3,90 – 5,27 0,9646 y=0,4669x–1,82934,56 – 5,2011Лейцин3,90 – 5,27 0,9789 y= 0,5433x–2,10074,42 – 4,9712Метионин3,90 – 5,27 0,9817 y=0,4770x– 1,85804,52 – 5,151813141516171819ПролинФенилаланинГлюкозаКсилозаРамнозаГалловая кислотаКверцетин3,90 – 5,543,90 – 5,275,13 – 6,334,42 – 5,223,54 – 4,643,54 – 5,364,89 – 5,365,02 – 6,024,39 – 4,974,65 – 5,942,12 – 6,123,83 – 4,52До 0,724,95 – 5,290,9056 y=0,2982x–1,19630,9851 y=0,5243x–2,00390,9616 y= 0,2321x–0,77890,9727 y=0,0750x+ 0,14090,9937 y=0,4367x–1,37360,9777 y =0,0827x+0,54070,9529 y=0,8792x–4,0492Таким образом, установлены закономерности элюирования и математическиемодели, описывающие хроматографическое поведение растительных БАВ в тонком слоесорбента (табл.
1). С помощью предложенных зависимостей можно подбиратьразличные системы для определения БАВ, чтобы величина Rf укладывалась воптимальные значения, а также прогнозировать возможность разделения сложныхмногокомпонентныхсмесей призаданнойвеличине полярностиэлюента.Посовокупности полученных результатов с позиций эффективности хроматографическогопроцессабыливыбраныитеоретическиобоснованыоптимальныеусловияхроматографирования изучаемых БАВ в тонком слое сорбента: элюент, проявитель,сорбент,объемпробы,чувствительностьопределения,полярностьсистемы.Обобщенные данные представлены в табл.
2.Таким образом, проведенные исследования показали, что определение иразделение в тонком слое сорбента гидрофильных и липофильных БАВ ЛРС присовместном присутствии и липофильных БАВ МЭ требует различных подходов иприемов.Алгоритмвыбораподвижнойфазыиприемовпроведенияхроматографического анализа БАВ ЛРС и МЭ приведен на схеме 1.Для исследования качественного состава БАВ и достижения четкого разделениязон на хроматограммах разработанные ВЭТСХ-методики с применением простого,фронтального или двумерного хроматографирования апробированы на изучаемом ЛРС.Результаты представлены в табл.
3. Хроматограммы извлечений из ЛРС (табл. 3) имеютнеодинаковый вид, обусловленный индивидуальным качественным составом БАВ нетолько в разных видах ЛРС, но и при использовании различных способов консервацииЛРС одного вида. В связи с этим, хроматографический профиль БАВ можноиспользовать для стандартизации и оценки доброкачественности сырья.19Таблица 2 – Характеристики разработанных методик разделения и идентификации изучаемых БАВ в тонком слое сорбента№п/пБАВ12β-каротинЭргокальциферол3Ретинола ацетат4α-токоферолЖРВ присовместномприсутствии5Рутин61415161718АскорбиноваякислотаГлюкозаКсилозаРамнозаАргининГлицинГлутаминоваякислотаВалинЛейцинМетионинПролинФенилаланин19Танин20Галловая кислота21Кверцетин78910111213Условия анализаЭлюентДетектирующий реагентБАВ ЛРС и МЭ липофильной природыгексан – бензол (29:1)гексан-хлороформ (4:1)5 % спиртовый раствор ФМК10% спиртовый раствор ФМК с конц.гексан: хлороформ (3:1)хлористоводородной кислотой (25:1)хлороформконц.
азотная кислотаэлюент 1 (высота пробега 8 см) – гексан-хлороформ(19:1); элюент 2 (высота пробега 6 см) – гексан5 % спиртовый раствор ФМКхлороформ (3:1)БАВ ЛРС гидрофильной природыэтилацетат-ледяная уксусная кислота-вода5 % спиртовый раствор NaOH(7,5:1,5:1,5)5 % спиртовый раствор ФМК или 0,2% спиртовыйэтилацетат-ледяная уксусная кислота (85:15)раствор 2,6- дихлорфенолиндофенолята натриян-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2)сульфаниламид и о-фталевая кислотаRfРПО, г0,38±0,010,35±0,010,100,881×10-57 ∙10-90,36±0,011,101·10-70,59±0,024,401·10-6---0,46±0,015,245∙10-70,42±0,014,594·10-70,29±0,020,45±0,010,55±0,020,11±0,010,34±0,012,5·10-65,691·10-81·10-81·10-80,35±0,01н-бутанол-ледяная уксусная кислота-вода (4:1:1)1 % спиртовый раствор нингидринаэлюент 1 (высота пробега 9 см) – диэтиловый эфируксусная кислота-гексан-этилацетат (20:20:20:40)1 % спиртовый раствор железо-аммонийныхквасцовэлюент 2 (высота пробега 7 см) – этилацетатмуравьиная кислота-уксусная кислота-вода(67:7,5:7,5:18)Р – полярность системы, рассчитанная по Л.
Снайдеру; ПО – предел обнаружения.0,52±0,010,64±0,020,55±0,020,29±0,020,68±0,010,15±0,010,91±0,020,83±0,020,97±0,010,08±0,010,84±0,015·10-65,135·10-83·10-83·10-810·10-83·10-83,545,5·10-73·10-79,681·10-620Схема 1. Алгоритм выбора подвижной фазы и приемов проведения хроматографического определения и разделения БАВ ЛРС и МЭ21Таблица 3 - Идентификация зон БАВ на хроматограммах извлечений из ЛРСОбъекты исследованияПлоды облепихиЛистья крапивыкрушиновиднойдвудомнойвысушенные№п/пБАВ1ОрганическиекислотыЩавелевая, винная,аскорбиновая кислота2Флавоноиды3АминокислотыРутин, кверцетинАргинин, пролин,глицин, глутаминоваякислота, валин*,лейцин*, фенилаланин*Плоды облепихикрушиновиднойсвежиеЩавелевая, винная,Щавелевая, винная,яблочная,лимонная, яблочная,аскорбиноваяаскорбиновая кислотакислотаРутин, гиперозид, кверцетинАргинин, пролин,Пролин, глицин,глицин, глутаминоваяглутаминоваякислота, лейцин*,кислота, лейцин*фенилаланин*ДубильныеТанин, галловая кислотаГалловая кислотавещества5 Простые сахараГлюкоза, ксилоза, рамноза*- здесь и далее - незаменимая АК4Для проведения количественного определения БАВ в исследуемом ЛРС присовместном присутствии с применением различных вариаций разработанных ВЭТСХметодик, на следующем этапе сразу же после проявления хроматографических зон накалибровочных хроматограммах, пластины сканируют и обрабатывают компьютерной программой«Sorbfil Videodensitometer».
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
