Б. Альбертс, А. Джонсон, Д. Льюис и др. - Молекулярная биология клетки (djvu) (1129766), страница 396
Текст из файла (страница 396)
Хромосомные перестройки в раковых плетках, к которым приводит амплификация гена. Представлен случай, когда несколько копий гена протоонкогена Мус амплифицированы. Ямплификация онкогенов очень характерна для карцином; часто она приводит к любопытному изменению кар ногина: клетка как будто содержит дополнительные пары миниатюрных хромосом — так называемые двойные минихромосомы — либо одна из ее нормальных хромосом, приобретающих полосатый вид при о к рашиванин, содержит однородно охрош ивою щийся участок. В обоих случаях зтн аномальные ору ктгры состоят из огромного количества копий небольшого сегмента генома.
На рисунке хромосомы окрашены красным флуоресцентным красителем, а множественные копии гена Мус выявлены методом гибридизации ю зво с желгпым флуоресцентным зондом. а) Кариотип клетки, в которой копии гена Мус представлены в виде деойньи минихромосом (парные желтые пяглнышки). 6) Кариотип клетки, в которой копии гена Мус представлены однородно окрашивающимся (в желтый цвети) участком одной из обычных хромосом. (Обычным копиям гена Мус соответствуют желтые точки, разбросанные по разным хромосомам,) е) Диаграмма, иллюстрирующая процесс амплификации. Считается, что в редких случаях нарушения репликации ДНК приводят к образованию хромосомы, в которой какой-то участок повторен многократно.
В результате репарации атой структуры получаются замкнутые на себя фрагменты ДНК, которые при репликации дают длинные тандемно повторяющиеся последовательности, образующие двойные минихрамосомы. В результате даугого редкого события ДН К одной из та них хромосом может встроиться в нормальную хромосому, образуя на ней однородно окрашивающийся участок. дмплификация может происходить и по-дгзугому (см. Рис. 20.41). (а и б — с любезного разрешения Оегйзе зиеес) Мус могут приводить разные обстоятельства. В некоторых случаях ген оказыва ется амплифицированным, то есть ошибки репликации ДНК приводят к тому, что в клетке оказывается множество копий одного и того же гена (см. рис. 20.34).
Чаще причиной повышенной выработки являются изменения в регуляторном элементе, влияюгцем на ген. Например, в результате хромосомной транслокации мощный регуляторный участок может случайно оказаться рядом с участком, кодирую щим белок Мус, что приведет в производству чрезвычайно Гюлыпого количества Мус мРНК. Так, в случае лимфомы Бсркита (новообразование из В клеток, часто встречается в Центральной Африке, реже — в США) транслокация помещает ген Мус под контроль последовательности, которая в норме управляет экспрессией 20.3.
Обнаружение генов, критичных дяя развития рака 1897 генов антител в В-лимфоцитах. В результате этого мутантные В-клетки ускоренно пролиферируют и формируют опухоль. Аналогичные хромосомные транслокации имеют место и в других лимфомах и лейкозах. 20.3.8. Охота на гены, ответственные за рак, продолжается Расшифровка человеческого генома открыла новые возможности систематического обнаружения генов, опосредующих развитие рака. Сейчас, благодаря разработке методов автоматического анализа геномной ДНК или матричной РНК, в принципе, стало возможным напрямую сравнить каждый из 25 000 генов раковой клетки с генами нормальной клетки и провести такой анализ в ряде случаев заболевания одной и той же формой рака, с тем чтобы выявить потенциально важные аномалии.
Анализируя таким образом многие формы рака, мы должны, в конце концов, идентифицировать все гены, мутации которых часто встречаются в раковых клетках человека. Несмотря на дороговизну таких экспериментов, широкомасштабные проекты по секвенированию ДНК с целью найти новые человеческие онкогены уже начались и дают первые результаты. Например, обнаружено, что гиперактивная форма протеинкиназы Ка( (см. главу 15) очень часто встречается в меланомах и реже — в других формах рака. Однако прямое секвенирование ДНК вЂ” не единственный способ решить поставленную задачу. Разработаны и другие мощные методы идентификации онкогенов и генов-супрессоров, которые, возможно, окажутся более эффективными.
Три из них представляются наиболее перспективными: 1. В методе сравнительной геномной гибридизации используют флуоресцентное мечение фрагментов ДНК, выделенной из нормальных и раковых клеток, чтобы выявить участки генома, в которых произошла амплификация либо утрата генетического материала(рис. 20.35). Затем проводят гибридизацию этих фрагментов с микроматрицей ДНК, в которой каждая лунка соответствует определенному положению в геноме. Различные точки флуоресцируют разными цветами согласно соотношению фрагментов нормальной ДНК и ДНК раковой клетки. Таким образом, можно указать участки генома раковой клетки, которые были амплифицированы или утрачены. Затем можно осуществить более целенаправленный поиск генов в тех участках, которые определили на прошлом этапе; 2.
Мнкроанализ также можно использовать при выявлении специфических для раковых заболеваний изменений характера экспрессии. В этом случае в качестве образца, с которым проводят гибридизацию, используют не хромосомную ДНК, а матричную РНК; 3. Наконец, недавно разработанный метод широкомасштабного генетического скрининга, основанного на технологии РНК-интерференции, представляет собой мощный функциональный подход к изучению генов опухолевых супрессоров. Малые интерферирующие РНК (э1КЫА) могут прямо в клетке инактивировать обе копии гена, привести к разрушению соответствующей мРНК либо ингибировать трансляцию определенного белка (см. главу 8, раздел 5.
18). Такой подход может оказаться очень эффективным при определении гена-супрессора, утрата функции которого стимулирует трансформации клетки конкретного животного или конкретной исследуемой линии. Независимо от того, какой подход используется, труднее всего определить, действительно ли обнаруженный ген имеет отношение к прогрессированию рака. к)) Рис. 20.3Б. Сравнительная геномная гибридизация, позволяющая детектировать изменения ДНК в опухоле выл клетках. а) Фрагменты ДНК из опухолевых и нормальных клеток метят двумя флуоресцентными метками (опухолевые — красной, нормальные клетки контрольной пробы — зеленой), после чего проводят гибридизацию с микроматрицей ДНК, каждая лунка которой соответствует определенному положению в нормальном геноме. б) На графике представлено отношения интенсивностей красной и зеленой флуоресценции в каждой точке.
Это соотношение позволяет выявить участки генома опухолевых клеток, в которых произошла амплификация либо делеция: красный сигнал говорит об амплификации, зеленый — об утрате копии гена. опухолевая нормальная ткань ткань .т)З г Ч)г ) ! иаояироВанная и фиуоресцентно . маченвягвноввшяДНК Мус ДНК а) микроматрица ЯНК е о Ь о Х я ф к и в е х локализация гена Мус : 3 амплификация гена '3 . ' .гбг г 60 80 100 120 140 80 » ос -2 Ь о 0 утрата копии гена 20 40 расстояние вдоль хромосомы в миллионах п.н.
В этом могут помочь эксперименты по уси.лению экспрессии предполагаемого он когена или подавлению активности предполагаемого гена супрессора в культуре клеток. Однако наиболее убедительными являются эксперименты на мышах. чьи клетки в избытке вырабатывают продукт предполагаемого онкогена, либо на мы шах, нокаутных по предполагаемому гену супрессору. В обоих случаях, если гены действительно способствуют заболеванию, то развитие раковой опухоли должно заметно стимулироваться. При поиске новых генов, опосредующих развитие рака, нам совершенно необяза тельно с самого начала представлять себе их функцию или то, каким именно образом их изменение может способствовать заболеванию раком.
Однако по мере накопления наших знаний становится проще «угадать», какой ген можно заподозрить в связи с раковым заболеванием, а затем напрямую проверить нашу догадку, особенно если 20.4. Молекулярные основы поведения раковых клеток 1899 этот ген часто мутирован в раковых клетках. Таким образом, поиск новых генов тесно связан с вьиснением их нормальной функции и ее нарушений, способствующих трансформации клетки в раковую. Об этом мы поговорим в следующем разделе. Заключение Гены, ответственные за развитие рака, можно разбить на две группы. В первую группу входят гены, повышение активности которых стимулирует развитие опухоли, во вторую — те гены, в случае которых к аналогичному эффекту приводит утрата или снижение активности.
Мутации, приводящие к повышению активности гена, стимулируют деление клеток в условиях, при которых нормальные клетки не делятся; мутации, снижающие экспрессию генасупрессора (или активность белка-супрессора) опухолей, отменяют ингибирующие влияния, которые обычно 'держат деление клетки под контролем. Онкогены доминантны, и многие из них впервые открытгя из-за того, что они вызывали рак у животных, зараженных ретровирусом, который содержал этот ген; предполагают, что протоонкоген клетки-хозяина случайно захватил геном ретровируса, мутировав при этом в онкоген. Онкогены могут также возникать в результате специфических хромосомных аберраций, активирующих протоонкоген. Мутации опухолевых супрессоров обычно рецессивны, так как клетки ведут себя нормально до тех пор, пока обе копии гена не будут утрачены или инактивированы, либо их экспрессия будет подавлена эпигенетически.
Несколько таких генов впервые обнаружено в редких наследственных формах рака, однако их утрата или инактивация, как оказалось, характерна и для спорадических форм. Люди, унаследовавшие одну мутантную копию гена опухолевого супрессора, более предрасположены к раковым заболеваниям, поскольку единственного изменения в любой клетке организма, приводящего к утрате или инактивации оставшейся функциональной копии гена, будет достаточно, чтобы полностью лишить клетку активности гена-супрессора. Поиск генов, ответственных за развитие рака, продолжается; разрабатываются все более мощные технологии систематического анализа ДНК и мРНК раковых клеток, позволяющие идентифицировать важные мутации и изменения характера экспрессии.
Участие найденного гена в развитии рака может быть проверено на мьпиах: в случае предполагаемого онкогена экспрессию необходимо искусственно повысить, а в случае предполагаемого онкосупрессора ген-мишень нужно инактивировать. 20.4. Молекулярные основы поведения раковых клеток Исследователь, стремящийся обнаружить гены раковых заболеваний, вынужден применять различные подходы для идентификации онкогенов и генов-супрессоров (а также их мутаций и эпнгенетических изменений), однако для раковой клетки это две стороны одной медали. Изменения в генах, принадлежащих разным классам, могут оказывать одно и то же влияние на поведение раковой клетки, так как большинство клеточных механизмов управления включают стимулирующий (протоонкогены) и ингибиторный (супрессоры опухолей) компоненты. Если цель состоит в том, чтобы на молекулярно-генетическом уровне понять, как функционируют раковые клетки, то важно различие не между онкогенами и генами-супрессорами, а между генами, отвечающими за различные биохимические и регуляторные пути.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
