Часть 3 (1129751), страница 52
Текст из файла (страница 52)
Это указывает на то, что они, по-видимому, принадлежат к двум эволюционнодалеким ветвям одного древнего семейства белков.Кристаллическая структура бактериородопсина высокого разрешения показала, что с определенными положениями на поверхности белка связано множестволипидных молекул (рис. 10.33, б). Предполагают, что взаимодействия со специфическими липидами способствуют стабилизации многих мембранных белков, которыелучше функционируют и проще кристаллизуются, если некоторые из этих липидовостаются связанными в процессе обработки детергентом или если определенныелипиды добавить обратно к белкам в растворе детергента. Специфичность такихлипид-белковых взаимодействий помогает объяснить, почему эукариотическиемембраны содержат такое разнообразие липидов, «головки» которых различаютсяпо размеру, форме и заряду.
Можно рассматривать мембранные липиды как двумерный растворитель для белков в мембране, точно так же как вода — трехмерныйрастворитель для белков в водном растворе. Некоторые мембранные белки способны функционировать только в присутствии специфических «головок» липидов,точно так же как многие ферменты в водных растворах требуют для своей работыопределенных ионов.10.2.9. Мембранные белки часто функционируют в составе крупныхкомплексовМногие мембранные белки функционируют в составе многокомпонентныхкомплексов, некоторые из которых изучены при помощи рентгеноструктурного анализа.
Фотосинтетический реакционный центр бактерий был первым закристаллизованным и проанализированным при помощи рентгеновской кристаллографиитрансмембранным белковым комплексом. Результаты этого анализа очень важныдля биологии мембран в целом, поскольку они впервые показали, как большое число полипептидов ассоциирует с мембраной и образует сложную белковую машину(рис. 10.34). В главе 14 мы обсудим, как такие фотосинтетические комплексы функционируют и улавливают энергию света для перекачки протонов через мембрану.Глава 10.
Структура мембраны 1107Многие мембранные белковые комплексы, участвующие в фотосинтезе, переносепротонов и электронном транспорте, имеют даже большие размеры, чем фотосинтетический реакционный центр. Например, огромный комплекс фотосистемы IIцианобактерий содержит 19 белковых субъединиц и более 60-ти трансмембранныхспиралей. Мембранные белки часто собираются в крупные комплексы не толькодля того, чтобы улавливать различные формы энергии, но и для трансформациивнеклеточных сигналов во внутриклеточные (см.
главу 15).Рис. 10.34. Трехмерная структура фотосинтетического реакционного центра бактерии Rhodopseudomonas viridis. Структура расшифрована посредством рентгеновской дифракции кристаллов этого трансмембранного белкового комплекса. Комплекс состоит из четырех субъединиц L, M, H и цитохрома.Субъединицы L и M формируют ядро реакционного центра, каждая из них состоит из пяти α-спиралей,пересекающих липидный бислой.
Черным показано расположение различных переносящих электронкоферментов. Обратите внимание, что коферменты расположены в пространстве между спиралями.«Специальная пара» молекул хлорофилла (см. главу 14) показана бирюзовым. (Адаптирован рис. J. Richardson, основанный на данных из J. Deisenhofer et al., Nature 318: 618–624, 1985. С любезного разрешенияиздательства Macmillan Publishers Ltd.)1108Часть IV. Внутренняя организация клетки10.2.10. Многие мембранные белки диффундируют в плоскостимембраныКак и большинство мембранных липидов, мембранные белки не переходятиз одного монослоя в другой (флип-флоп), но вращаются вокруг оси, перпендикулярной плоскости бислоя (вращательная диффузия). Более того, многие мембранные белки способны латерально мигрировать в пределах мембраны (латеральнаядиффузия).
В первом эксперименте, напрямую доказавшем, что некоторые белкиплазматической мембраны обладают подвижностью в плоскости бислоя, клеткимыши искусственно слили с клетками человека для получения гибридных клеток(гетерокарионов). Чтобы различать белки плазматической мембраны человекаи мыши, использовали два по-разному меченых антитела. Несмотря на то чтосначала мышиные и человеческие белки оставались в пределах своих половинокновообразованного гетерокариона, примерно через полчаса два набора белков диффундировали и смешались по всей клеточной поверхности (рис. 10.35).Скорость латеральной диффузии мембранных белков можно измерить при помощи метода восстановления флуоресценции после фотоотбеливания (FRAP).Обычно, интересующий мембранный белок метят специфической флуоресцентнойгруппой. Это можно сделать либо при помощи флуоресцентного лиганда, например,связывающего белок меченного флуорофором антитела, либо при помощи методарекомбинантных ДНК, позволяющего экспрессировать белок, сшитый с зеленымфлуоресцентным белком (GFP) (см.
главу 9). Затем в маленькой области мембраныфлуоресцентную группу отбеливают лазерным лучом и измеряют время, необходимоесоседним, несущим неотбеленный лиганд или GFP мембранным белкам для того,чтобы диффундировать в отбеленную область (рис. 10.36, а). Это метод дополняетпотеря флуоресценции при фотоотбеливании (Fluorescence Loss in Photobleaching, FLIP). В этом подходе лазерный луч постоянно освещает маленький участокмембраны и отбеливает все флуоресцентные молекулы, которые в него диффундируют. Таким образом, постепенно окружающая мембрана лишается флуоресцентномеченых молекул (рис. 10.36, б). Измерения FRAP и FLIP позволяют рассчитатькоэффициенты диффузии маркированных мембранных белков.
Значения коэффициентов диффузии существенно изменяются для разных мембранных белков и разныхклеток, поскольку взаимодействия с другими белками в разной степени замедляютдиффузию белков. Измерения для белков, которые наименее подвержены этомупроцессу, показывают, что клеточные мембраны имеют вязкость, сопоставимуюс вязкостью оливкового масла.Одним из недостатков методов FRAP и FLIP является тот факт, что они позволяют наблюдать движение только крупных популяций молекул в относительнобольшой области мембраны; они не позволяют следить за отдельными белками.Например, если белок не мигрирует в отбеленную область, нельзя сказать, являетсяли молекула неподвижной или ее движение просто ограничено некоторой областьюмембраны, например белками цитоскелета.
Метод отслеживания траекторийотдельных частиц (single-particle tracking) позволяет преодолеть эту проблемупутем мечения отдельных мембранных молекул связанными с флуоресцентнымикрасителями антителами или мельчайшими частицами золота и наблюдения ихдвижения в видеомикроскопе. При помощи отслеживания траектории отдельныхчастиц можно записать траекторию диффузии единственной молекулы мембранногобелка во времени. Результаты, полученные всеми этими методами, показали, чтоГлава 10.
Структура мембраны 1109Рис. 10.35. Эксперимент, демонстрирующий диффузию белков в плазматической мембране гибридных(мышиных и человеческих) клеток. Сначала мышиные и человеческие белки содержатся в своих половинках новообразованной плазматической мембраны гетерокариона, но со временем они смешиваются.Два использованных для визуализации белков антитела различаются в флуоресцентном микроскопе,поскольку флуоресцеин имеет зеленый цвет, а родамин — красный. (Основано на L. D. Frye and M. Edidin,J. Cell Sci. 7: 319–335, 1970.
С любезного разрешения The Company of Biologists.)белки плазматической мембраны значительно различаются по своим диффузионнымхарактеристикам, это мы обсудим ниже.10.2.11. Белки и липиды могут придерживаться определенныхдоменов в пределах мембраныПризнание того факта, что биологические мембраны представляют собойдвумерную жидкость, сыграло большую роль в понимании структуры и функций1110Часть IV. Внутренняя организация клеткиРис. 10.36.
Измерение скорости латеральной диффузии мембранного белка методами фотоотбеливания. Интересующий белок можно экспрессировать в составе химерного белка с зеленым флуоресцентнымбелком (GFP), который флуоресцирует сам по себе. (а) В методе FRAP в маленькой области лазернымлучом отбеливают флуоресцентные молекулы.
Интенсивность флуоресценции восстанавливается,по мере того как обесцвеченные молекулы диффундируют из облученной области, а неотбеленныемолекулы диффундируют в нее (здесь показан вид сверху и сбоку). Коэффициент диффузии рассчитывают из графика скорости восстановления: чем выше коэффициент диффузии мембранного белка, тембыстрее происходит восстановление. (б) В методе FLIP маленький участок мембраны постоянно освещается, а флуоресценция измеряется в другой области.
Флуоресценция во второй области непрерывноснижается, по мере того как флуоресцентные молекулы ее покидают, а отбеленные молекулы в неевходят. В конце концов все флуоресцентные молекулы будут отбелены, при условии, что они подвижныи не заякорены в цитоскелете или внеклеточном матриксе.Глава 10. Структура мембраны 1111мембраны. Однако стало ясно, что представление мембраны как липидного моря,в котором свободно плавают все белки, было значительным упрощением. Многиеклетки ограничивают движение мембранных белков пределами определенныхобластей в непрерывном липидном бислое. Мы уже обсуждали, как молекулыбактериородопсина в пурпурных мембранах Halobacterium собираются в крупныедвумерные кристаллы, в которых отдельные молекулы практически неподвижныотносительно друг друга (см. рис. 10.32); такого рода крупные агрегаты диффундируют очень медленно.В эпителиальных клетках, выстилающих, например, желудочно-кишечныйтракт или почечные канальцы, определенные ферменты и транспортные белки плазматической мембраны содержатся только на апикальной поверхности клеток, тогдакак другие – только на базальной и латеральной поверхностях (рис. 10.37).
Такоеасимметричное распределение мембранных белков часто необходимо для функционирования эпителия (см. обсуждение в главах 11 и 19). Липидный составэтих двух мембранных доменов также различается, следовательно, эпителиальные клетки способны ограничить диффузию между доменами не только молекулбелков, но и липидов. Однако эксперименты с мечеными липидами показали, чтотакие ограничения действуют только на липиды во внешнем монослое мембраны.Барьеры, создаваемые особым типом межклеточных контактов (носящих названиеплотных соединений, или запирающих зон, см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
