Часть 3 (1129751), страница 51
Текст из файла (страница 51)
Наиболее полезнымиреагентами для биохимика являются детергенты, представляющие собой малыеамфифильные молекулы различной структуры. Детергенты лучше растворяютсяв воде, чем липиды. Их полярные (гидрофильные) концы могут быть заряженными(ионными), как у додецилсульфата натрия (ДСН), или незаряженными (неионными), как у октилглюкозида и «Тритон» (рис. 10.29, а).
В малых концентрацияхдетергенты в растворе представляют собой мономеры, но когда их концентрацияпревышает пороговое значение, называемое критической концентрацией мицеллообразования, или ККМ, они агрегируют с образованием мицелл (рис. 10.29, б–в).Молекулы детергентов быстро переходят из мицелл в раствор и обратно, поэтомуконцентрация мономеров в растворе остается постоянной вне зависимости от того,сколько образовалось мицелл.
ККМ и среднее число молекул детергента в мицеллеявляются индивидуальными характеристиками детергента, но они также зависятот температуры, pH и концентрации соли. Растворы детергентов, таким образом,являются сложными системами, и их трудно изучать.При смешении с мембранами гидрофобные концы детергентов связываютсяс гидрофобными областями мембранных белков, где они замещают липидные мо-Глава 10. Структура мембраны 1101Рис. 10.29.
Структура и функции мицелл детергентов. (а) Наиболее широко используют три детергента:анионный детергент додецилсульфат натрия (ДСН) и два неионных детергента β-октилглюкозид и «ТритонX-100». «Тритон X-100» представляет собой смесь соединений, в которых участок в квадратных скобкахповторяется 9–10 раз. Гидрофобная часть детергентов показана желтым, гидрофильная — оранжевым.(б) При маленьких концентрациях молекулы детергентов присутствуют в растворе в виде мономеров. Кактолько их концентрация достигает критической концентрации мицеллообразования (ККМ), часть молекулдетергента образует мицеллы. Обратите внимание, что концентрация мономеров детергента остаетсяпостоянной при концентрации, превышающей ККМ. (в) Поскольку молекулы детергента обладают какполярными, так и неполярными концами, они амфифильны; и поскольку они имеет форму конуса, ониобразуют мицеллы, а не бислои (см.
рис. 10.7). Мицеллы детергентов имеют нерегулярную форму, иза счет ограничений упаковки гидрофобные «хвосты» частично экспонированы в воду. Пространственнаямодель показывает предсказанную методом молекулярной динамики структуру мицеллы, составленнойиз 20 молекул β-октилглюкозида. (б, адаптировано из G. Gunnarsson, B. Jönsson и H. Wennerström, J. Phys.Chem. 84: 3114–3121, 1980; в, из S. Bogusz, R. M. Venable and R. W. Pastor, J. Phys. Chem.
B. 104: 5462–5470,2000. С любезного разрешения American Chemical Society.)лекулы. Поскольку противоположный конец молекул детергента полярен, такоесвязывание приводит к тому, что мембранные белки переходят в раствор в видекомплексов белок-детергент (рис. 10.30). Обычно, с белком остается связаннымнекоторое количество молекул липидов.Сильные ионные детергенты, например ДСН, способны солюбилизовать дажесамые гидрофобные мембранные белки. Это позволяет анализировать белки при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (описанного1102Часть IV. Внутренняя организация клеткиРис. 10.30.
Солюбилизация мембранных белков мягким неионным детергентом. Детергент нарушаетлипидный бислой и переводит белки в раствор в составе комплексов «белок-липид-детергент». Фосфолипиды мембраны также солюбилизируются детергентом.в главе 8), метода, который совершил революцию в изучении мембранных белков.Такие сильные детергенты разворачивают (денатурируют) белки за счет связыванияс их внутренним «гидрофобным ядром». В результате белки становятся неактивными, и их нельзя использовать для функциональных исследований. Однако белкиможно легко разделить и очистить в их денатурированной ДСН форме. В некоторых случаях удаление детергента позволяет очищенному белку ренатурироватьи восстановить свою функциональную активность.Многие гидрофобные мембранные белки можно солюбилизовать и затемочистить в активном состоянии при помощи мягких детергентов.
Эти детергентыпокрывают гидрофобные области на погруженных в мембрану сегментах, которыестановятся доступными после удаления липидов, но не разворачивают белок. Есликонцентрацию детергента в растворе солюбилизированной мембраны уменьшить(например, разбавив раствор), мембранные белки перестают быть растворимыми.В присутствии избытка молекул фосфолипидов в таком растворе мембранные белки встраиваются в самопроизвольно образующиеся маленькие липосомы. Такимобразом, можно воссоздавать функционально активные системы мембранных белков из очищенных компонентов.
Это позволяет анализировать функционированиемембранных транспортеров, ионных каналов, сигнальных рецепторов и так далее(рис. 10.31). Например, при помощи такой функциональной реконструкции быладоказана гипотеза о том, что трансмембранная ATPаза использует градиенты H+в мембранах митохондрий, хлоропластов и бактерий для синтеза ATP.Детергенты также сыграли ключевую роль в очистке и кристаллизации мембранных белков.
Развитие новых детергентов и систем экспрессии, позволяющих получатьГлава 10. Структура мембраны 1103Рис. 10.31. Использование мягких неионных детергентов для солюбилизации, очистки и воссозданияфункциональных систем мембранных белков. В данном примере показана очистка и встраиваниев фосфолипидные везикулы молекул Na+/K+-насоса.
Na+/K+-насос — это ионный насос, присутствующийв плазматических мембранах большинства животных клеток; он использует энергию гидролиза ATPдля выкачивания Na+ из клетки и закачки K+ в клетку, как описано в главе 11.большие количества мембранных белков из клонов кДНК, привело к стремительномуувеличению числа структур мембранных белков и белковых комплексов.10.2.8. Бактериородопсин — это светозависимый протонный насос,пересекающий липидный бислой в форме семи α-спиралейВ главе 11 мы рассмотрим, как многопроходные трансмембранные белки опосредуют селективный транспорт малых гидрофобных молекул через клеточные мембраны.Но исчерпывающее понимание того, как мембранный транспортный белок работает,1104Часть IV.
Внутренняя организация клеткитребует точной информации о его трехмерной структуре в бислое. Бактериородопсинбыл первым мембранным транспортным белком, чью структуру удалось расшифровать. Он остается шаблоном для многих многопроходных мембранных белковсо сходной структурой и, несомненно, заслуживает краткого отступления.«Пурпурная мембрана» археи Halobacterium salinarum представляет собойспециализированную «бляшку» на плазматической мембране, несущую единственный вид белковых молекул — бактериородопсин (рис. 10.32). Каждая молекулабактериородопсина содержит одну поглощающую свет группу, или хромофор(так называемый ретиналь), который придает белку пурпурную окраску. Ретиналь – это альдегидная форма витамина А, и он идентичен хромофору родопсинафоторецепторных клеток глаз позвоночных (см.
главу 15). Ретиналь ковалентносвязан с боковой цепью остатка лизина белка бактериородопсина. При активацииединственным фотоном света, возбужденный хромофор меняет форму, что приводитк последовательности небольших конформационных изменений белка. В результате,один H+ переносится из цитоплазмы во внешнюю среду (рис. 10.33). На яркомсвету каждая молекула бактериородопсина способна выкачивать наружу несколькоРис. 10.32.
Бляшки пурпурных мембран археи Halobacterium salinarum, содержащие бактериородопсин. (а) Эти археи обитают в соленых водоемах, доступных для солнечного света. В процессе эволюцииони создали множество светозависимых белков, включая бактериородопсин, который представляетсобой светозависимый протонный насос в плазматической мембране. (б) Молекулы бактериородопсинав бляшках пурпурных мембран плотно упакованы в двумерные кристаллы. (в) Изображение молекулярной поверхности, полученное при помощи атомно-силовой микроскопии.
Этот метод позволяетувидеть отдельные молекулы бактериородопсина. (г) Схема примерного расположения трех мономеровбактериородопсина и их α-спиралей, наложенная на изображение на (б). (б–в, с любезного разрешенияDieter Oesterhelt.)Глава 10. Структура мембраны 1105сотен протонов в секунду. Светозависимый транспорт протонов создает градиентH+ через плазматическую мембрану, за счет которого, в свою очередь, происходитсинтез ATP вторым белком в мембране плазматической клетки.
Энергия, запасаемаяв форме градиента H+, также используется в клетке для других энергозатратныхпроцессов. Таким образом, бактериородопсин преобразует солнечную энергиюв градиент протонов, который обеспечивает энергией клетку археи.Рис. 10.33. Трехмерная структура молекулы бактериородопсина. (а) Полипептидная цепь семь разпересекает липидный бислой в форме α-спиралей. Показаны положение хромофора ретиналя (фиолетовый) и возможный путь откачки протонов после активации светом. Первым и самым важным этапомявляется перенос H+ с хромофора на боковую цепь аспарагиновой кислоты 85 (красная, расположенарядом с хромофором), который происходит после поглощения ретиналем фотона. Затем переноситсядругой H+ в указанном числами порядке при помощи боковых цепей аминокислот, выстилающих путьчерез мембрану.
Цикл завершается, и белок возвращается в исходное состояние. Цветовые обозначения: глютаминовая кислота (оранжевая), аспарагиновая кислота (красная), аргинин (синий). (б) Кристаллическая структура бактериородопсина высокого разрешения показала, что с определеннымиположениями на поверхности белка связано множество липидов (желтые с красными «головками»). (а,адаптировано из H. Luecke et al., J. Mol. Biol. 291: 899–911, 1999. С любезного разрешения издательстваAcademic Press.)Многочисленные молекулы бактериородопсина в пурпурной мембране организованы в плоский двумерный кристалл.
Такая регулярная упаковка позволилаопределить трехмерную структуру и ориентацию бактериородопсина в мембранес умеренным разрешением (3 Å) при помощи подхода, в основе которого лежатэлектронная микроскопия и дифракция электронов. Этот метод, известный какэлектронная кристаллография, аналогичен изучению трехмерных кристаллов растворимых белков посредством рентгеновской дифракции.
Он позволил получитьпервые структурные данные о многих мембранных белках, которые слишкомсложно кристаллизовать в растворе детергента. В случае бактериородопсинаструктура, полученная при помощи электронной кристаллографии, была впо-1106Часть IV. Внутренняя организация клеткиследствии подтверждена и уточнена при помощи рентгеноструктурного анализаочень высокого разрешения. Каждая молекула бактериородопсина состоит из семиплотно упакованных α-спиралей (каждая из которых содержит около 25 аминокислот), пересекающих липидную мембрану под значительно отличающимисяуглами. После получения высокоупорядоченных кристаллов и их заморозкипри очень низкой температуре также стало возможным определение структурынекоторых промежуточных конформаций, которые белок принимает в течениецикла переноса H+.Бактериородопсин — член крупного суперсемейства мембранных белковсо сходной структурой, но отличными функциями.
Например, родопсин в палочках сетчатки позвоночных и многие рецепторные белки на поверхности клетки,связывающие внеклеточные сигнальные молекулы, также состоят из семи трансмембранных α-спиралей. Эти белки работают скорее как трансформаторы сигнала,а не транспортеры: они отвечают на внеклеточный сигнал путем активации внутриклетки GTP-связывающего белка (G-белка) и, соответственно, называются рецепторами, сопряженными с G-белком (G-Protein-Coupled Receptor, GPCR). Мыобсудим их в главе 15. Несмотря на то что структуры бактериородопсина и G-белковудивительно похожи, их аминокислотные последовательности совершенно различны.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
