Том 3 (1129748), страница 49
Текст из файла (страница 49)
В качестве тестового материала чащевсего использовались линии клеток, выведенных от фибробластов мыши. Считают,что эти клетки, заранее отобранные по способности к неограниченному делениюв культуре, уже содержат генетические изменения, приближающие их к злокачественным клеткам. Поэтому введения одного онкогена должно быть достаточнодля того, чтобы вызвать сильный эффект.Чтобы определить таким образом онкоген, ДНК выделяют из клеток опухоли,фрагментируют и вводят в культивируемые клетки. Если какой-нибудь фрагментсодержит онкоген, то начинают появляться небольшие колонии аномально пролиферирующих клеток; поскольку клетки, формирующие эти колонии, обладаютсвойствами, присущими раковым клеткам, их называют трансформированными,или претерпевшими трансформацию.
Каждая колония представляет собой клонклеток-потомков одной-единственной клетки, в которую проник онкоген, снимающий с нее некоторые из ограничений. Трансформированные клетки, формирующиеколонию, размножаются значительно быстрее других клеток и напластываютсядруг на друга по мере пролиферации (рис. 20.29).Этот метод позволил выделить и секвенировать первый человеческий онкоген,представляющий собой мутантный вариант протоонкогена Ras. На сегодняшнийдень известно, что ген Ras мутирован примерно в каждом пятом случае ракау человека.
Открытие человеческого онкогена Ras было тем более интригующе,что незадолго до этого мутантный ген Ras обнаружили в геноме ретровируса, вызывающего саркому у грызунов, причем именно этот ген был ответственен за образование опухоли. Разумеется, что открытие в начале 1980-х гг. одного и тогоже онкогена в опухолевых клетках человека и в геноме вируса опухоли животныхпоразило всех. Осознание того, что причиной рака служат мутации в ограниченномчисле особых генов, изменило наше представление о молекулярно-биологическихосновах этого заболевания.Как обсуждалось в главе 15, нормальные белки Ras представляют собой мономерные GTPазы, участвующие в передаче сигнала от рецепторов на поверхностивнутрь клетки.
Онкоген Ras, выделенный из опухолевых тканей человека, содержитточечные мутации, делающие белок Ras гиперактивным: такой белок неспособенк самоблокировке при гидролизе связанного GTP до GDP. Ввиду повышенияактивности белка этот эффект доминантен, то есть для его проявления достаточноизменить лишь одну из двух копий гена. Поскольку ген Ras мутирован во многихформах рака у человека, он остается одним из наиболее важных примеров генов,ответственных за рак.1890Часть 5. Клетки в контексте их совокупностиРис. 20.29. Потеря способности к контактному торможению в культуре клеток.
Большинство нормальныхклеток перестают делиться, как только они в один слой покрывают дно чашки: похоже, что способностьк делению зависит от соприкосновения с чашкой и подавляется при контакте с другими клетками. Этоявление называется контактным торможением. Однако на раковые клетки эти ограничения обычноне действуют, и они продолжают размножаться, нагромождаясь друг на друга.Пользуясь только описанными методами, а также применяя другие подходы,исследователи обнаружили несколько сот протоонкогенов — генов, активирующая мутация в которых превращает их в онкогены, способствующие заболеванию раком.20.3.4. Гены-супрессоры опухоли впервые обнаруженыпри исследовании редких наследственных форм опухолейЧтобы идентифировать ген, инактивированный в геноме раковой клетки, необходимо применять другие методы, нежели в случае активируемого гена: невозможно, к примеру, использовать метод трансформации клеток для обнаружениятого, чего заведомо нет.
Основной прорыв в этой области исследований связанс изучением редкой формы рака человека — ретинобластомы. Эта опухоль развивается из клеток сетчатки глаза, перешедших в раковое состояние; для этогоим требуется необычно малое количество мутаций. Как часто бывает в биологии,к открытию привело исследование частного случая, в ходе которого обнаружилиген, имеющий огромное значение для разных видов рака. Действительно, гены,обнаруженные при изучении редких семейных форм рака, как правило, играютбольшую роль в распространенных спорадических формах, причем зачастую онивыступают в роли супрессоров.Ретинобластомой заболевают в детстве, и опухоли развиваются из предшественников нейронов в незрелой сетчатке. От этого заболевания страдает примерно одинребенок из 20 000.
Одна из форм болезни является наследственной, другие — нет.При наследственной форме множественные опухоли обычно возникают независимодруг от друга в обоих глазах. При ненаследственной форме поражается один глази лишь одной опухолью. В некоторых случаях клетки ретинобластомы имеют хорошо20.3. Обнаружение генов, критичных для развития рака 1891выраженные аномалии кариотипа — в том числе делецию особого фрагмента 13 хромосомы.
Наследование этой аномалии обуславливает предрасположенность к болезни. Делеции в этом же участке встречаются также в клетках некоторых пациентовс ненаследственной формой болезни; это свидетельствует о том, что к заболеваниюпривела потеря важного гена, чей локус находился в этом участке.Используя данные о локализации этой хромосомной делеции, стало возможноклонировать и секвенировать ген Rb. Обнаружено, что у тех, кто страдал от наследственной формы заболевания, во всех соматических клетках отсутствовалаодна копия гена Rb либо эта копия содержала мутацию, приводящую к снижениюактивности гена.
Эти клетки предрасположены к трансформации, но не становятсяраковыми, пока сохраняют действующую копию гена. В раковых клетках сетчаткиотсутствуют (или нарушены) обе копии гена Rb, так как в них произошла модификация генома, приведшая к потере функционирующей копии гена.У пациентов с ненаследственной формой болезни, напротив, неопухолевыеклетки содержат обе нормальные копии гена Rb, а раковые — дефектны по обоималлелям. Эти ненаследственные формы ретинобластомы очень редки, поскольку дляих возникновения необходимы два независимых события, инактивирующих одини тот же ген в двух гомологичных хромосомах (т. е.
в паре хромосом № 13) в одномиз клонов клеток сетчатки (рис. 20.30). Ген Rb также отсутствует в нескольких спо-Рис. 20.30. Генетические механизмы возникновения ретинобластомы. При наследственной формеболезни во всех клетках тела одна из двух нормально функционирующих копий гена опухолевогосупрессора Rb отсутствует, и та клетка, в которой утрачивается или инактивируется оставшаяся копия(в результате мутации или эпигенетической модификации), становится опухолевой.
При ненаследственнойформе болезни клетки содержат обе функциональные копии, и опухоль возникает там, где обе копииоказываются инактивированными, то есть где в одном клоне клеток дважды происходит генетическоеили эпигенетическое изменение.1892Часть 5. Клетки в контексте их совокупностирадических формах рака, в том числе в случае карцином легких, молочной железыи мочевого пузыря.
Эти более распространенные формы рака обусловлены болеедлинной цепью генетических изменений, чем в случае ретинобластомы, и проявляютсягораздо позже. Однако, по-видимому, для всех этих форм потеря функции Rb зачастую является основным шагом к прогрессированию злокачественной опухоли.Ген Rb кодирует белок Rb, универсальный регулятор клеточного цикла, присутствующий почти во всех клетках тела (см. рис. 17.62). Он действует как один из основных факторов, тормозящих цикл деления, и, как мы обсудим в дальнейшем, потеряего активности приводит к несанкционированному вступлению в клеточный цикл.20.3.5. Опухолевые супрессоры могут быть идентифицированыпри исследовании самих опухолейИстория с геном Rb показывает, как редкие наследственные формы ракапомогают выявить опухолевые супрессоры, играющие важную роль и в других,более распространенных, случаях.
Однако таким образом открыто всего нескольковажных генов-супрессоров. Более прямой подход состоит в сравнении опухолевых клеток с нормальными клетками того же пациента, с тем чтобы определить,какие именно из трех миллиардов нуклеотидов, составляющих геном человека,отсутствуют, составляют нарушенную последовательность или незаконно «замалчиваются». Ввиду генетической нестабильности изменений обычно много.Большинство изменений возникло случайно, просто из-за нестабильности генома.Следовательно, критерием истинного гена-супрессора должна служить повторяемость результата — отсутствие гена, его нарушение или сайленсинг — во многихнезависимых случаях одной и той же формы ракового заболевания.
«Выследить»ген-супрессор таким образом — задача трудная, но вполне выполнимая при использовании современных методов широкомасштабного анализа ДНК (см. далее).На сегодняшний момент хорошо охарактеризованы несколько десятков геновопухолевых супрессоров, а еще большее число потенциальных онкосупрессоровизучено недостаточно хорошо.20.3.6. Инактивация гена опухолевого супрессора можетпроисходить как генетически, так и эпигенетическиОсновную опасность представляет собой именно инактивация гена опухолевогосупрессора. Она может происходить по-разному вследствие ряда различных причин, ведущих к элиминации или приведению в негодность обеих копий гена.
Однаиз копий может быть, к примеру, утеряна в результате небольшой хромосомнойделеции или инактивирована точечной мутацией. Вторая копия обычно теряетсяв результате неспецифического, но более вероятного процесса: хромосома, несущая оставшуюся нормальную копию, может быть утрачена в результате невернойсегрегации хромосом либо нормальный ген может быть заменен мутантной формойв результате рекомбинации или конверсии гена.На рис.
20.31 на примере гена Rb показаны возможные пути утраты оставшейсяфункциональной копии гена-супрессора при изменении последовательности ДНК.Важно отметить, что все механизмы, за исключением точечной мутации, приводятк тому, что в клетке остаются однотипные нуклеотидные последовательности тогоучастка хромосомы, который содержит локус Rb гена, — и эти последовательностиидентичны последовательности мутантной хромосомы.20.3.
Обнаружение генов, критичных для развития рака 1893Рис. 20.31. Шесть способов лишиться оставшейся функциональной копии гена-супрессора опухоли.Клетка, у которой нарушена одна из двух копий гена-супрессора (например, гена Rb), обычно ведет себякак нормальная, здоровая клетка; на схеме показано, как клетка может утратить оставшуюся функциональную копию гена, начав тем самым превращаться в опухолевую. Седьмая возможность, представленнаяна рис. 20.32, состоит в подавлении экспрессии гена эпигенетической модификацией, без измененияпоследовательности ДНК (что часто и происходит с некоторыми генами-супрессорами).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
