Лекционный курс (1128712), страница 16

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 16)

После транспортировки кода из ядрак рибосомам происходит собственно синтез белковых молекул, путем присоединенияотдельных аминокислотных остатков к растущей полипептидной цепи.Сборка ферментов:1) Сворачивание (при этом повышается стабильность)2) Посттрансляционная модификация – это химическая модификация белка послеего трансляции. После трансляции посттрансляционная модификация расширяетфункциональный состав белка посредством дополнительного присоединения такихгрупп, как ацетатная (ацетилирование) или фосфатная (фосфорилирование)группы, а также липидов и сахаров (гликозилирование).3) Встраивание кофакторов4) Формирование активных центров.Некоторые ферменты выполняют каталитическую функцию сами по себе, безо всякихдополнительных компонентов. Однако есть ферменты, которым для осуществлениякатализа необходимы компоненты небелковой природы. Кофакторы могут быть какнеорганическими молекулами (ионы металлов, железо-серные кластеры и др.), так иорганическими (например, флавин или гем).

Органические кофакторы, прочно связанныес ферментом, называют также простетическими группами. Кофакторы органическойприроды, способные отделяться от фермента, называют коферментами.Фермент, который требует наличия кофактора для проявления каталитическойактивности, но не связан с ним, называется апо-фермент. Апо-фермент в комплексе скофактором носит название холо-фермента. Большинство кофакторов связано сферментом нековалентными, но довольно прочными взаимодействиями. Есть и такиепростетические группы, которые связаны с ферментом ковалентно, например,тиаминпирофосфат в пируватдегидрогеназе.4.Методы выделения биополимеров: особенности итрудности.

Методыфракционирования белков. Хроматография, электрофорез и изоэлектрическаяфокусировка. Критерии чистоты ферментных препаратовОсновные трудности:1) Большое разнообразие и незначительные различия в структуре2) Низкое содержание фермента в исходном биоматериале3) Высокая степень удерживания4) Низкая стабильность- собственная- происходит отделение стабилизирующих факторов (мембраны)- повреждение молекулы (гидролиз цепи)- запуск действия активаторов (пероксиды)1) Методы фракционирования:1) Использование органических растворителей (ацетон, этанол) - понижениерастворимости многих аминокислот и белков.2) Использование минеральных солей - уменьшается электростатическоеотталкиваниеодноимённо заряженных полиионов, что может приводить к осаждению некоторыхкомпонентов.523) Дробное осаждение.4) Центрифугирование.5) Гельфильтрация с использованием «молекулярных сит».6) Диализ (отделение от низкомолекулярных компонентов при пропускании черезполупроницаемые мембраны).7) Ультрафильтрация.Виды хроматографии: газожидкостная (распределение вещества между газом ижидкостью), ионообменная (распределение анионов и катионов на ионообменной смоле),аффинная (распределение вещества между фазами за счёт химического взаимодействия сносителем; например, белки хорошо удерживаются целлюлозой, активированнойбромцианом), тонкослойная (распределение вещества между подвижной и неподвижнойфазами по полярности); если сорбент полярен, а растворитель неполярен, то реализуетсяобычная ТСХ; в обратном случае происходит обращённо-фазовая ТСХ.Основные сорбенты и носители: целлюлоза и её модификации, сефадексы, сефарозы,полистиролы, полиакриаламиды, силикагели.Электрофорез - разделение заряженных частиц в электрическом поле.

Условиеэлектрофореза: f v = neV, где / - коэффициент вязкого трения, Y - скорость перемещениячастицы, V - потенциал внешнего электрического поля. На коэффициент вязкого трениявлияют: величина и форма молекул, заряд; для наибольшей компенсации этих эффектовдо электрофореза проводят денатурацию, химическими методами разделяя белок наотдельные аминокислотные последовательности.Изоэлектрическая фокусировка - разделение белков в среде с градиентом рН,создаваемым внешним электрическим полем (значение рН возрастает от анода к катоду).В такой среде белок движется в соответствии со знаком своего заряда до достиженияизоэлектрической точки. Для поддержания градиента рН в раствор вводят так называемыеамфолины - короткие полимерные молекулы, содержащие карбоксильные и аминогруппы,то есть амфолиты. В электрическом поле эти молекулы расходятся по своимизоэлектрическим точкам и создают градиент pH, одновременно работая в качестве буфера.На основании какого-то одного теста на гомогенность говорить о чистоте ферментаможно лишь с какой-то долей вероятности.

Эта вероятность увеличивается прииспользовании нескольких тестов и в этом случае фермент может быть признан чистым.Большинство тестов на гомогенность основаны на определении физических свойствбелка. С помощью ультрацентрифугирования и гель-фильтрации проводятдифференцировку по размеру молекул, а электрофорез и изоэлектрическое фокусированиепозволяют дифференцировать белки по заряду. Если фермент имеется в большомколичестве, его чистоту можно проверить по тесту растворимости. Существуют тесты,основанные на определенной каталитической активности фермента.

На данный момент,можно получить фермент с более 99% чистотой.5.Энергия и силы в биосистемах. Взаимодействия в белковой молекуле:ковалентные,водородныесвязи,гидрофобныеиэлектростатическиевзаимодействия.Ковалентные связи - пептидная и дисульфидные мостики. Характерные значенияэнергий ковалентных связей (AG гидролиза): (-5) - (-30) кДж/моль. -CH2-SH + HS-CH2 ------- >-CH2-S-S-CH2-.Водородные связи - слабые связи, возникающие за счёт притяжения несущего малыйположительный заряд атома водорода к атомам, заряженным отрицательно (кислороду,азоту, галогенам). Характерные значения энергий: 0.1 - 2 ккал/моль.Гидрофобные взаимодействия возникают за счёт перестройки системы водородныхсвязей воды вблизи неполярной гидрофобной группы. Вода вытесняет гидрофобнуюмолекулу или группу (А) в гидрофобную область белка.53Величина гидрофобного взаимодействия характеризуется величинамиAG = -RT In[A]белок/[A]вода или π = lg([A]белок/[A]вода) - константагидрофобности Ганча.

В пересчёте на одну СН2-группу энергетический эффектгидрофобного взаимодействия составляет АН = -0.57 ккал/моль, TAS = 0.34 ккал/моль.Электростатические взаимодействия - обычно достаточно слабы и проявляютсялишь в сильно полярных растворах, где протонированная и потому заряженнаяположительно аминогруппа притягивается к депротонированной и заряженнойотрицательно карбоксильной группе - образуется солевой мостик. Характерные значенияэнергий (AG разрыва солевого мостика) (-3) - (-4) ккал/моль.6.

Уровни структурной организации белков: первичная, вторичная, третичная ичетвертичная структуры, понятие о сверхвторичных структурах и доменах.Первичная структура белка - последовательность аминокислотных остатков, соединённыхпептидными связями. В природных белках Особенности пептидной связи - /(C-N) на 10%меньше, чем в других молекулах, вращение затруднено; преимущетвенно трансRконфигурация.

Примеры аминокислот (указан R): Н (Gly - глицин), CH3 (Ala - аланин).Вторичная структура белка - стабилизация последовательности аминокислотных остатковза счёт нековалентных взаимодействий близко расположенных участков молекулы.Известныдватипавторичныхструктур:a-спиралъ(полипептиднаяцепь сворачивается в спираль за счёт водородных связей между аминогруппой икарбонильной группой, находящейся в четвёртом от этой аминогруппы пептидномфрагменте), (Р-складки (две полипептидные цепи связываются друг с другом; при этомвозможны параллельная или антипараллельная.Третичная структура белка - стабилизация вторичной структуры за счёт образованияконтактов между отдельными её частям; образуется молекула белка, внутри которойобычно находится изолированное от воды «гидрофобное ядро».Четвертичная структура белка - образование ассоциатов молекул, строение которыхуникально и определяется первично структурой белка.Супервторичная структура – структура, полученная при взаимодействии α-α, α-β, β- β.Доме́н белка́ — элемент третичной структуры белка, представляющий собой достаточностабильную и независимую подструктуру белка.

Сворачивание домена в третичнуюструктуру происходит независимо от других частей белка. Некоторые белки имеют 2домена, причем активный центр находится на стыке этих доменов. Кол-во доменов можноопределить с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии по количествупорогов.7. Стабильность белков (ферментов).

Денатурация и инактивация. Принципыстабилизации ферментовФерменты стабильны при невысоких температурах (40-50 градусов) в диапазоне pH от 5до 8. Денатурация белка – потеря белком (ферментом) специфических свойств вследствиенарушения пространственной структуры их молекул. Таким образом, скоростьденатурации зависит от значения pH и температуры. Тепловая инактивация ферментовпочти всегда является результатом денатурации белка.

(наступает при Т=70) Процессденатурации характеризуется высокой энергией активации.Принципы стабилизации ферментов:1) Иммобилизация2) Химическая модификация3) Стабилизация фермента кофакторами4) Стабилизация солями5) Стабилизация ферментов субстратом548. Химическая модификация белков (ферментов). Виды ферментных препаратов.9. Классификация ферментов. КФ 1: Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление.Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа КФ 2: Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одноймолекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы,переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ. КФ3: Гидролазы,катализирующие гидролиз химическихсвязей.Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза,липопротеинлипаза КФ 4: Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза собразованием двойной связи в одном из продуктов. КФ 5: Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения вмолекуле субстрата.55КФ 6: Лигазы, катализирующие образование химическихсубстратами за счет гидролиза АТФ.

Характеристики

Список файлов лекций