Лекционный курс (1128712), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Для установленияпервичной структуры ДНК недавно предложен экспресс-метод, включающий применениедвух ДНК-полимераз (из E.coli и из бактериофага Т4). Однако во всех этих случаяхопределяется структура небольшого участка ДНК, поэтому полная расшифровкапервичной структуры ДНК генома человека ждет своего решения.ДНК может быть выделена из любого биологического материала: из крови и другихжидкостей организма, различных типов тканей и клеток, содержащих ядра. У человекаДНК чаще всего выделяют из лейкоцитов крови.
Процесс выделения ДНК состоит изнескольких этапов: быстрый лизис клеток, удаление фрагментов клеточных органелл имембран, ферментативное разрушение и экстрагирование белков, осаждение молекулДНК в этаноле с последующим их растворением в буферном растворе. Оценку качествавыделенной ДНК проводят на основании измерения оптической плотности раствора ДНКв области белкового и нуклеинового спектров поглощения. В чистых образцах ДНКсоотношение А(260)/А(280) > 1,8; где А(260) и А(280) — оптическая плотность растворапри длине волны 260 и 280 нм, соответственно.Для научных исследований ДНК не только вьщеляют из биологического материала.
но иполучают синтетически при использовании ДНК-синтезаторов - приборов дляавтоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химического синтезаот биологического состоит в присоединении каждого нового нуклеотида к 5'гидроксильному концу цепи, а не к З'-концу.3. Полимеразная цепная реакция.Полимеразная цепная реакция – способ воспроизведения генетического материала безучастия векторов и клеток-хозяев. Для осуществления такой реакции необходимы двапраймера и термостабильная ДНК-полимераза (выделяемая из термофильныхмикроорганизмов). Вначале исходную ДНК нагревают до 901 для разделения цепей, затемсмесь охлаждают происходит присоединение праймеров, после чего на этих праймерахначинается синтез новых цепей. Многократное воспроизведение достигается повторениемэтой процедуры; каждый раз в промежутке между двумя праймерами образуется парановых цепей, полностью идентичных исходным.4.
Рестриктазы. Полиморфизм длины рестрикционных фрагментов.Рестриктазы – (ферменты, рестрикции), группа бактериальных нуклеаз, специфическирасщепляющих ДНК. Предохраняют бактериальные клетки от чужеродных ДНК (напр.,вирусных). Широко используются при определении первичной структуры ДНК, длякартирования генов и в генетической инженерии для создания и клонирования гибридныхмолекул ДНК.Рестриктазы подразделяют на 3 класса. К первому классу принадлежат ферменты (напр.,ЕсоК из Escherichia coli К12), узнающие специфич. последовательность сайта, норазрывающие нить ДНК в произвольной точке (по-видимому, после образованиякомплекса с ДНК фермент неспецифически взаимод. с удаленной областью ДНК илипередвигается вдоль нити ДНК). Ко второму классу принадлежат ферменты (напр.,EcoRI), расщепляющие ДНК в строго определенной точке но отношению к сайтуузнавания.
К третьему классу относят ферменты промежут. типа (напр., EcoPI),разрывающие нить ДНК в неск. точках на разном удалении от сайта узнавания.46Наиб. значение имеют рестриктазы второго класса, широко применяемые в генетическойинженерии и при установлении структуры ДНК. Эти ферменты (мол. масса, рН оптим.каталитич.
активности и рI значительно варьируют в зависимости от источника)расщепляют обе нити ДНК. При этом разрыв осуществляет иногда одна молекуларестриктазы в обеих нитях, иногда-две молекулы фермента (каждая атакует лишь однунить, как, напр., EcoRI). В большинстве случаев 3', 5'-фосфодиэфирные связи в ДНКрасщепляются с образованием 5'-фосфатов на месте разрыва молекулы (см. Нуклеиновыекислоты), лишь немногие рестриктазы (напр., Nсil) образуют фрагменты с 3'-фосфатнымигруппами. Все рестриктазы второго класса-Mg2+-зависимые ферменты. Для нек-рыхрестриктаз (напр., EcoRI) установлена первичная структура.Расщепление ДНК происходит обычно в пределах сайта узнавания, редко-наопределенном расстоянии от него.
При этом образуются фрагменты ДНК либо с ровными(тупыми) концами, либо с выступающими (липкими) 5'- или З'-концами (см. рис.).Рестриктазы с одинаковыми сайтами узнавания наз. изошизомерами.Схема расщепления ДНК разными рестриктазами: А, С, G и Т-соотв. дезок-сиаденозин,дезоксицитидин, дезоксигуанозин и дезокситимидин; N-любой дезоксинуклеозид,ферменты; 1-HalIII, 2-EcoI, 3-BglI, 4-HgaI.Применение рестриктаз второго класса позволяет вырезать из ДНК определенныефрагменты, а также встраивать их в заданные места векторных молекул ДНК, т. е.направленно конструировать молекулы с новой генетич.
информацией.5. Дактилоскопия ДНКДНК-дактилоскопия или генетическая дактилоскопия представляет собой метод,используемый в судебно-медицинской экспертизе для идентификации лиц на основеуникальности последовательностей ДНК индивидуума. Метод был открыт в 1984 годубританским генетиком Алеком Джеффризом. Рассматривая рентгеновские снимки ДНК,он обнаружил, что ДНК разных людей имеют уникальные последовательностинуклеотидов. Последовательности ДНК конкретного человека составляют его ДНКпрофиль или генетический паспорт, который можно использовать для идентификацииличности.
Составление ДНК-профиля человека (ДНК-профилирование) не следует путатьс полной рашифровкой его генома.Хотя 99,9% последовательностей ДНК человека совпадают по составу, тем не менее ДНКразных людей достаточно индивидуальны.[1] В ДНК-профилировании анализируетсяколичество повторяющихся элементов в выбранном участке генома.
Это количествоназывается тандемным повтором и является вариабельным. Чем больше участков генома(или локусов) анализируется при составления ДНК-профиля, тем выше точностьидентификации личности. В настоящее время число локусов для составления ДНКпрофиля достигает 16 и более.6. Клонирование.
Примеры терапевтического клонирования.Клонирование — метод получения нескольких генетически идентичных организмовпутем бесполого (в том числе вегетативного) размножения.Овца До́лли — первое теплокровное животное, полученное из генетического кода другоговзрослого существа путем клонирования.Генетическая информация для процесса клонирования была взята из взрослыхдифференцированных (соматических) клеток, а не из половых (гамет) или стволовых.Самого исходного животного (прототипа) на момент клонирования уже не существовало.А часть его клеток, необходимая для эксперимента, была своевременно заморожена ихранилась в жидком азоте чтобы сохранить и передать генетический материал. Сама47Долли стала самой известной овцой в истории науки. Она прожила 6,5 лет и оставилапосле себя 6 ягнят.
Долли умерла в 2003-м году от эвтаназии.7. Конструирование рекомбинантных ДНК.Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке)двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.Ключевыми в этом определении являются слова "фрагмент ДНК" и "объединение in vitro",что указывает на сущность генетической инженерии и ее отличие от всех остальныхметодов получения гибридных (или химерных) организмов, таких как генетическаяселекция, эмбриональная инженерия и т.д.Фрагменты ДНК, в том числе и фрагменты, содержащие гены, получают сиспользованием ферментов рестриктаз.
Рестриктазы могут образовывать фрагменты как ступыми, так и с липкими концами. Сшивка фрагментов ДНК производится тремяосновными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемыхДНК.1) Сшивка по одноименным "липким" концам (рестриктазно лигазный метод)2) Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами3) Сшивка по "тупым" концам (коннекторный метод)8. Генная инженерия - 4 основных этапа.
Векторная ДНК, введение ДНК в клетку,клонирование, идентификация клонов.Основными задачами генетической инженерии являются искусственный синтез белков нарибосомах живой клетки, а также селективное изменение типичных белков клетки за счётизменения её генетического кода. Для этого в ДНК клетки нужно ввести соответствующиенеобходимому белку гены. По этой причине главной задачей генной инженериистановится отбор необходимых генов, их размножение и внедрение в клетки длявыработки белка.Отбор генетического материала производится несколькими способами: можносинтезировать искомую последовательность нуклеотидов химическими методами, можновыделить из клеток, содержащих этот ген, все м-РНК (и перевести их в ДНК с помощьюобратной транскрипции см.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
